依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验条件探索

目的对依赖于靶点稳定性的药物亲和反应（DARTS）这一靶标发现新技术进行主要影响因素的探索,获得DARTS更适宜的实验条件。方法采用不同浓度的链霉蛋白酶（酶与蛋白质量比1∶100~1∶10 000）对Jurkat细胞提取的蛋白混合物进行室温酶解,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色,观察不同浓度链霉蛋白酶对蛋白混合物酶解的程度,以确定DARTS适宜的酶解浓度范围。在此基础上,以α-酮戊二酸为研究对象,采用DARTS联合SDS-PAGE,考察不同链霉蛋白酶浓度（酶与蛋白质量比为1∶500~1∶5000）和不同酶解时长（5~30 min）对DARTS结果的影响,获得适宜的酶解条件。选用靶标已知的麦考酚酸,采用上述实验所得的最适酶解条件进行DARTS,验证其可行性。结果采用不同浓度链酶蛋白酶对蛋白混合物进行酶解时,浓度为1∶100的条件下蛋白完全被水解,酶浓度为1∶10 000对蛋白混合物无明显水解,酶浓度为1∶500~1∶5000较温和,约可水解蛋白混合物的30%~60%。链霉蛋白酶浓度为1∶1000时,α-酮戊二酸的DARTS中受保护的蛋白条带呈现效果最好;在该酶浓度条件下,适宜的酶解时长为15 min。将以上酶解条件（链霉蛋白酶浓度1∶1000、酶解15 min）运用于麦考酸的DARTS,在4~7×10~4处可见明显的保护条带,Western免疫印迹法验证结果显示,保护条带中含有麦考酚酸靶蛋白IMPDH 1。结论以α-酮戊二酸为研究对象,获得了蛋白混合物DARTS更适宜的实验条件。

药物亲和反应的靶点稳定性技术及其应用研究进展

药物靶标是指存在于组织细胞内与药物相互作用,并赋予药物效应的特定分子,>98%药物靶标为蛋白质。药物与细胞内靶标相互作用,是药物发挥作用的基础。如何综合运用多种研究方法发现和确证药物作用新靶标是目前研究者面临的重要挑战。药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)技术是根据小分子药物与其靶标蛋白结合后导致对蛋白酶敏感性下降而发展起来的一项新技术,由于无需药物保护性修饰且无药物活性依赖性,因此可广泛应用于药物筛选与靶标鉴定。本文对DARTS技术的发现、技术原理及方法要点和应用进行综述。

抗结核活性化合物HY-152E的作用靶点分析

抗结核活性化合物HY-152E是本实验室前期获得的具有良好抗结核活性并拥有授权专利(ZL201210088290.0)的小分子化合物(最低抑菌浓度≤0.09μg/m L)。为深入探索HY-152E的抗结核机制,本研究利用药物亲和反应靶点稳定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)技术并结合蛋白质谱技术,分析可能与HY-152E相互作用的结核分枝杆菌潜在靶标蛋白。将结核分枝杆菌H37Ra的菌体蛋白裂解液与HY-152E共同孵育,用不同浓度的链霉菌蛋白酶消化30、45、60 min后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离并比较与HY-152E互作前后菌体蛋白耐受蛋白酶消化的差异条带,分别在相对分子质量70 000左右和45 000~55 000处观察到差异蛋白条带。利用蛋白质谱技术分析差异条带的蛋白信息,共获得86个蛋白信息。结合结核分枝杆菌数据库及蛋白功能信息,最终筛选到9个蛋白可能是HY-152E的抗结核作用潜在靶标。这些潜在靶标的确定,为后续研究HY-152E的抗结核分子机制奠定了基础。

基于DARTS技术的丹参素钠直接结合靶蛋白鉴定

目的:鉴定丹参素钠在人脐静脉内皮细胞中可能直接结合的靶蛋白。方法:首先利用药物亲和反应靶点稳定技术(DARTS),结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定丹参素钠在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中可能直接结合的靶蛋白,并通过免疫印迹法(Western blotting)进行验证。然后采用表面等离子共振技术(SPR)分析丹参素钠与其潜在靶标蛋白的结合动力学参数。结果:丹参素钠在HUVEC细胞中特异性结合CD44蛋白,两者之间的结合常数为4.84×10^(-4) mol·L^(-1)。结论:丹参素钠可能通过结合靶蛋白CD44发挥心血管的保护作用。

非化学修饰的药物靶点发现技术在中药研究中的应用

中医药是我国的科学与文化瑰宝,具有数千年的临床用药经验。中医药在复杂疾病及慢性疾病防治方面具有显著优势,在当前全球肆虐的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)防治中也彰显了其优势,但由于作用机制不清楚等问题严重限制了其推广应用。化学药治疗疾病作用机制明确,具有成熟的药物靶点发现技术,主要包括化学修饰技术和非化学修饰技术。中药具有多成分、多靶点的作用特点,应用化学修饰技术进行作用靶点的研究具有一定的局限性。因此,主要介绍细胞热位移分析、分子对接技术、药物亲和反应的靶点稳定性和表面等离子共振技术等非化学修饰的药物靶点发现技术的原理、操作流程和应用,并对其在中药作用机制研究中的潜在优势与不足进行讨论,以期探索出一种中药作用靶点发现模式,为中药作用机制的阐明提供参考与借鉴,助推中医药现代化进程。

Rasfonin潜在结合蛋白的发现及其对胰腺癌细胞增殖影响的初步研究

目的寻找对Kras突变胰腺癌增殖具有选择性抑制作用的化合物rasfonin的结合蛋白,研究其潜在结合蛋白对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响,为其抗胰腺癌的机制研究提供线索。方法运用依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(DARTS)方法获得可能与rasfonin结合的耐酶解电泳条带,经质谱鉴定、Mascot分析后得到潜在结合蛋白。设计针对这些蛋白的siRNA片段,qPCR法检测siRNA干扰效率。选择干扰效率最高的siRNA转染Panc-1细胞,CCK8法检测细胞增殖率。结果对得到的电泳条带进行解析后得到11种与肿瘤密切相关的蛋白,对相关基因进行siRNA干扰实验后检测细胞增殖情况,结果显示敲降YBX1、LAP3基因抑制Panc-1细胞增殖;敲降PPP2R5E基因促进Panc-1细胞增殖;敲降其他基因对Panc-1细胞增殖无明显影响。结论 YBX1、LAP3和PPP2R5E基因对Panc-1细胞的增殖具有明显影响,但其与rasfonin发挥抗肿瘤作用的关系尚需深入研究。