依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究(英文)

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒,使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明:位于inlC启动子转录起始点下游22bp处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的”PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。

复方甘草甜素下调细胞周期素依赖性激酶1启动子表达

目的:了解复方甘草甜素调节细胞周期素依赖性激酶 1(CDK1)基因启动子的活性,为甘草甜素的作用机制提供理论依据． pCAT3-basic空载体的12．4倍,是甘草甜素刺激转染pCAT3- CDK1-P的HepG2细胞的9．3倍．结论:复方甘草甜素可以下调CDK1基因启动子的活性,进而下调CDK1基因的表达,为深入了解甘草甜素在肝纤维化和肝癌中的作用机制提供新的分子生物学依据．

外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象

外源性导入哺乳动物细胞的双链DNA会经历重组、重排及其他复杂的分子生化反应。极少数DNA分子会随机整合到宿主基因组,即发生水平基因转移。然而,目前还不清楚这些外源性DNA分子在不含有特殊启动子的情况下是否能被细胞的转录机器识别并起始转录。在构建环状RNA(circ RNA)表达体系的过程中,发现了外源性DNA分子能经历不依赖启动子的转录,而且转录本会发生符合"GU-AG"法则的RNA剪接进而产生类似于环状RNA的异常剪接分子。进一步研究表明,外源DNA在哺乳动物细胞中不依赖于启动子的转录和剪接现象是保守的。揭示了外源DNA在哺乳动物细胞中的一个新的命运途径,该发现对研究外源性DNA对宿主细胞的影响具有重要意义及应用价值。

前列腺特异性启动子rPB的改造及其载体质粒的构建和活性测定

目的 构建一个前列腺特异性的、可启动针对雄激素非依赖性前列腺癌的基因治疗的改良启动子并测定其活性。方法 选择前列腺特异性启动子rPB ,通过两次PCR对其进行改造,用维甲酸反应元件(RARE)替代雄激素反应元件(ARE)或直接插入RARE ,构建成为不同拷贝条件的rPB DR ,并与质粒连接。转染细胞后,进行荧光素酶活性测定。结果 通过电泳鉴定及基因测序,证实构建成功。结论 根据实验设计,构建出的rPB DR应具有在维甲酸的调控下,针对雄激素非依赖性前列腺癌特异性启动基因治疗的功能,现构建成功不同拷贝条件的rPB DR ,证实实验设计构想,同时通过活性测定比较各种拷贝条件的rPB DR启动子活性的优劣,为下一步与治疗基因的连接及功能测定奠定基础。

TERT基因启动子区域突变与神经胶质瘤的相关研究进展

肿瘤的一个重要特性就是肿瘤细胞的无限增殖,这一特性可以通过基因变异实现端粒长度的维持,从而解除细胞周期的限制来实现[1-2]。对黑色素瘤的研究表明,体细胞端粒长度的维持主要有两种机制：端粒酶依赖性机制（85%）和端粒酶非依赖性机制（15%）[3],后者依靠ATRX和DAXX变异介导的端粒替代延长机制（ALT）实现端粒的延长;

中国汉族人HLA-DQA1启动子区核酸序列分析

本文报告汉族人HLA－DQAI启动子区（QAP）基因多态性。汉族人HLA－DQA1Xbox第-111位是腺苷酸（A）而不是鸟苷酸（G），-98位可是A或G；Ybox-71位为A；Sbox-131位为G；IDDM患者在Sbox5’上游和X、Ybox之间易发生单个核苷酸取代。并发现1例携带DR2－IDDM患者AAP的-157和-158位间发生CCA核苷酸插入突变。提示HLA－DQA1启动子区多态性可能在ID－DM的遗传易感性中起着重要作用。

具有前列腺癌特异性的启动子rPB-DR的活性测定

目的测定本组构建的一个前列腺特异性的、可启动针对雄激素非依赖性前列腺癌的基因治疗的改良启动子rPB-DR的活性。方法将已构建的4种不同拷贝条件的rPB-DR,与质粒连接,转染细胞后,进行荧光素酶活性测定。结果测定结果显示用维甲酸反应元件(RARE)替代雄激素反应元件(ARE)或直接插入RARE,保持了该启动子的活性。结论根据实验设计,构建出的rPB-DR应具有在维甲酸的调控下,针对雄激素非依赖性前列腺癌特异性启动基因治疗的功能,现构建成功不同拷贝条件的rPB-DR,通过活性测定证实了实验设计构想,也比较了各种拷贝条件的rPB-DR启动子活性的优劣,为下一步与治疗基因的连接及功能测定奠定基础。

前列腺癌自杀基因治疗中组织特异性启动子的研究进展

随着自杀基因治疗成为治疗恶性肿瘤的重要方法,其中组织特异性启动子是目前研究的热门之一。前列腺癌自 杀基因治疗常用的组织特异性启动子有PSA及Probasin等,其中PSA,Probasin为雄激素依赖性,对于未经雄激素去势治疗的 前列腺癌治疗效果较好;而PSMA为雄激素非依赖性,对于是否经过雄激素去势治疗的前列腺癌均有良好疗效,适用范围广。

细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

番茄钙依赖性蛋白激酶基因LeCPK2在热(光)胁迫中的功能鉴定

钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs or CPKs)作为一类钙感知蛋白在植物的生长发育和胁迫应答中起着重要的作用。LeCPK2(GenBank accession No.:GQ205414)是我们从番茄中分离的第3个CDPK基因,前期研究表明LeCPK2可能在植物热胁迫应答中发挥作用。为了进一步研究其在热胁迫中的功能,我们通过电子克隆的方法分离了LeCPK2的启动子序列,并通过LeCPK2过表达烟草分析其在高温胁迫中的潜在的功能。生物信息学分析显示,LeCPK2启动子中包含5个热响应元件,和前期试验结果一致。野生型植株在受到热胁迫后,对光更为敏感,强光照下植株叶片发生萎蔫,而强光本身不会对未受热胁迫的健康植株造成伤害。LeCPK2转基因植株热、光胁迫后不会出现受害表型。以上研究表明,LeCPK2在植物的热胁迫应答中发挥重要作用,能够有效保护植株免受高温胁迫的损害,是一个优秀的耐热(光)基因。本研究将为揭示番茄LeCPK2遗传功能及对其开发利用奠定基础。

激素依赖型肾病综合征患儿NPHS2基因突变

目的分析中国激素依赖型肾病综合征(SDNS)汉族儿童NPHS2基因突变及其特点。方法分别取1例SDNS患儿及其父母、弟弟(汉族)及50例尿检正常成年人外周静脉血各3mL,枸橼酸钠抗凝,提取基因组DNA。应用PCR方法扩增NPHS2基因的全部8个外显子及其启动子全长,对PCR扩增产物直接进行DNA测序。结果在SDNS患儿NPHS2基因外显子5上检测到1个杂合错义突变-596A>T;在NPHS2基因外显子8上检测到1个杂合同义突变-954T>C。在该患儿NPHS2基因启动子区检测到-116C>T纯合变异,其母亲和弟弟NPHS2基因上也检测到596A>T的杂合错义突变和954T>C杂合同义突变。在其父亲和弟弟NPHS2基因启动子区检测到-116C>T杂合变异。但患儿的父母和弟弟尿检均正常。596A>T为新发现的突变,导致NPHS2基因的编码蛋白podocin的第199位的天冬氨酸(位于stomatin蛋白家族的高度保守区)变为异亮氨酸,即N199I。分析对照人群100条染色体,未发现NPHS2基因596A>T突变;但检测到954T>C同义突变和-116C>T变异。结论汉族肾病综合征患儿对激素依赖可能与NPHS2基因突变有关。

基于生物信息学研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A基因与宫颈癌的关系及调控机制

目的采用生物信息学方法分析细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)基因与宫颈癌的关系,并探讨其对宫颈癌潜在的调控机制。方法从GEO数据库中下载数据集GSE7803、GSE64217和GSE63514,并使用GEO2R软件筛选宫颈癌组织和正常组织之间的差异性表达基因,得到CDKN2A基因在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达情况,并利用GEPIA数据库验证CDKN2A基因在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达水平。通过DAVID在线工具针对差异性表达基因进行通路富集分析;利用STRING数据库和Cytoscape软件筛选与CDKN2A基因编码蛋白相互作用密切的蛋白。利用UALCAN在线工具分析CDKN2A基因表达与宫颈癌患者临床病理特征及预后的关系,以及宫颈癌组织中CDKN2A基因启动子甲基化水平。利用TIMER数据库分析CDKN2A基因表达水平与肿瘤免疫细胞浸润的相关性。利用ENCORI和mirDIP软件分析与CDKN2A基因有结合靶点的miRNA。结果共获得347个差异性表达基因,其中CDKN2A基因为上调基因;GEPIA数据库验证结果提示CDKN2A基因在宫颈鳞状细胞癌组织组织中呈高表达水平(P<0.05)。CDKN2A基因参与了细胞周期、p53信号通路及膀胱癌信号通路;共有22个蛋白与CDKN2A基因编码蛋白相互作用密切。淋巴结转移阳性宫颈癌患者中的CDKN2A基因表达水平高于淋巴结转移阴性者,CDKN2A基因高表达的宫颈癌患者的生存期短于低表达者(均P<0.05)。宫颈癌组织中CDKN2A基因启动子的甲基化水平较正常宫颈组织升高(P<0.05)。CDKN2A基因表达水平与巨噬细胞浸润水平呈负相关,与中性粒细胞、树突状细胞浸润水平呈正相关(均P<0.05)。共有9个miRNA可能与CDKN2A基因有结合靶点。结论CDKN2A基因与宫颈癌发生、发展密切相关,或可作为宫颈癌诊断及预后评估的潜在新分子标志物,并可为研究宫颈癌的免疫治疗提供新线索;该基因可能通过启动子区域甲基化或上游miRNA靶向调控在宫颈癌的发生、发展中发挥作用。

人类胆囊收缩素基因的新遗传多态性及其与酒精依赖的关系

目的分析人胆囊收缩素基因遗传多态性及其与酒精依赖的关系。方法基于荧光的单构象变化分析及PCR直接测序的方法分析了66名日本人、66名美国白人、52名中国人和41名哥伦比亚原住民前胆囊收缩素原基因启动子和编码区的新遗传变异,并通过对10对孪生子家庭的分离,分析确定了两等位基因的遗传方式。还对66名健康对照日本人和108名酗酒者的基因型分布及等位基因频率进行了分析。结果发现了两个核苷酸变异体:其中一个频繁突变处于启动子Sp1结合顺式结构的核心区-45位置,是一个C和T的置换;另一个位于内含子2的1 662处,也是一个C和T的置换。结论这两个遗传变异属于新基因多态性,呈共显性遗传。酗酒者中等位基因的T变异体的频率明显的高于对照组,而且两组中这些基因型的分布亦存在明显的差异。

单核细胞增生李斯特菌毒力基因aroA启动子上阻碍PrfA转录调控元件的研究

目的研究食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM）毒力基因启动子的结构特点及其与转录调控因子PrfA（positive regulatory factorA）蛋白之间的关系。方法选取picA和aroA两个毒力基冈启动子作为研究对象，picA基因启动子（PplcA）上含有一个高度保守的PrfA蛋白结合序列TFAACAAATGTFAA（PrfA-box）和-10区（TAAGAT），其转录表达受PrfA强调控；aroA基因不受PrfA调控，所利用的启动子ParoA1为非依赖于PrfA的启动子，但是在紧邻ParoA1的下游区域却含有一个与PplcA相似的PrfA—box（TTAAAACATGTTAA）和一个-10区（TTTAAT），该区域疑似为依赖于PrfA的启动子，被命名为ParoA2。应用PCR定点突变和SOEing PCR（重叠区扩增基因拼接法）技术互换了Pplca和ParoA2上可能影响PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列，构建了一系列PplcA—ParoA2杂合突变启动子，并插入到无启动子的lacZ报告基因上游，使lacZ基因的表达置于突变启动子下。获得的启动子融合表达质粒分别电转化入LM野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中，检测相应的β-半乳糖苷酶活性以确定杂合突变启动子是否具有依赖PrfA的转录活性及其水平高低。结果当启动子上影响PrfA转录调控的两个核心元件PrfA—box与-10区的距离保持在最适的22或23个碱基时，交换印M和ParoA2上的两个相应核心元件的碱基序列并不改变启动子的转录活性。但是，当PplcA上的两个核心元件之间的碱基以及-10区下游的序列被相应ParoA2上的序列所替代后，PplcA依赖于PrfA的转录活性完全丧失，反之，ParoA2上的这两段序列如果被PplcA的序列所替换，ParoA2则表现出依赖于PrfA的转录活性。结论ParoA2的-10区及其下游的序列可能形成发夹结构，阻碍RNA聚合酶-PrfA蛋白复合物结合到解旋的单链模板DNA上生成具有转录起始活性的开放复合物，从而抑制了ParoA2依赖于PrfA的转录活性的表达。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27基因在胃癌中表达及其与启动子甲基化的关系

目的探讨细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27（p27^KiP1）在胃癌中的表达及其与基因启动子甲基化的关系。方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白．过氧化物酶（SP）法检测97例胃癌标本p27^KiP1蛋白的表达，并选取25例正常胃黏膜组织作对照，同时应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法对启动子甲基化进行检测。结果正常胃黏膜组织中p27^KiP1蛋白表达率明显高于胃癌组（X2=31．02，P〈0．01）。在高／中分化组、黏膜层／黏膜下层组和无淋巴结转移的病例中，p27^KiP1蛋白表达率分别为66．67％（30／45）、92．86％（13／14）、79．07％（34／43），但随着胃癌分化程度的降低，侵及肌层／浆膜层或发生淋巴结转移，p27^KiP1蛋白表达率明显降低，分别为30．77％（16／52）、39．76％（33／83）、22．22％（12／54）（，值分别为12．47、13．55、31．03，P〈0．01）。46例p27^KiP1蛋白高表达病例中仅有5例出现启动子甲基化，而在51例p27^KiP1蛋白低表达病例中启动子甲基化高达21例（X2=11．32，P〈0．01）。结论p27^KiP1与胃癌发生发展密切相关。p27^KiP1蛋白表达降低常提示胃癌的低分化、高侵袭转移能力。p27^KiP1基因启动子甲基化可以引起p27^KiP1蛋白表达下调或缺失．与胃癌的发牛发展密切相关．

多巴胺D4受体基因启动子区功能多态性与海洛因依赖的相关性研究

目的:探讨多巴胺D4受体(DRD4)基因启动子区的3个功能多态性位点与海洛因依赖的相关性。方法:严格按照诊断标准,选取无亲缘关系的海洛因依赖患者212例及健康对照组200例提取基因组DNA,采用聚合酶链反应及等位基因特异性扩增技术检测DRD4基因启动子区-521C/T、-616C/G、及-1240L/S3个功能多态性位点的基因型,采用HaploView及SPSS11.5软件分析各位点基因型、等位基因频率及组间差异。结果:DRD4基因-521C/T的基因型及等位基因频率分布在海洛因依赖组与正常对照组存在显著性差异(p<0.05)。结论:多巴胺D4受体(DRD4)基因-521C/T多态性与海洛因依赖相关联,T等位基因可能是海洛因依赖的风险因子。

周期素依赖性激酶4抑制因子基因启动子甲基化与口腔颊癌发生发展的关系

目的探讨p16基因启动子甲基化在口腔颊癌发生发展中的作用。方法对颊黏膜白斑10例、颊癌30例的新鲜标本采用MSP、Western blot杂交分析p16甲基化和p16蛋白表达情况。结果颊癌p16甲基化率高于颊部白斑(P<0·05);颊癌有颈淋巴结转移组p16甲基化率高于无转移组(P<0·05);颊癌p16蛋白失表达与pl6基因甲基化呈正相关(P<0·01)。结论启动子甲基化是导致p16基因失活的主要方式,与颊癌的发生、转移有密切关系。

胃癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27基因蛋白表达、基因突变及其与启动子甲基化的关系

目的探讨胃癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27基因（P27^KiPI）蛋白表达、基因突变及启动子甲基化的关系。方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR—SSCP）技术、甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）方法分别检测97例胃癌中^KiPI基因蛋白表达、基因突变及启动子甲基化，并选取25例正常胃黏膜组织作对照。结果正常胃黏膜组织中^KiPI蛋白高表达率明显高于胃癌组（χ^2=31．02，P〈0．01）。早期胃癌组中^KiPI蛋白高表达率也高于进展期胃癌组（χ^2=13．55，P〈0．01）。正常胃黏膜组织中未检测到基因突变及启动子甲基化，胃癌组织中检测到^KiPI基因突变及启动子甲基化，但在早期胃癌及进展期胃癌中两者差异无统计学意义（χ^2=0．13、0．32，P〉0．05）。46例^KiPI蛋白高表达病例中仅有5例出现启动子甲基化，而在51例^KiPI蛋白低表达病例中启动子甲基化高达21例，另有5例出现基因突变（χ^2=17．89，P〈0．01）。结论^KiPI蛋白的表达下调或缺失与胃癌的发生发展有关。^KiPI基因突变及启动子甲基化在胃癌的早期阶段就可能已经发生并保存下来。^KiPI基因启动子甲基化及基因突变，特别是启动子甲基化可以引起^KiPI蛋白表达下调或缺失。

CopG蛋白介导的DNA弯曲对σ^(54)依赖型启动子转录起始的调控作用

以glnAp2,nifLp和glnHp2为研究对象,在不改变上游序列增强子元件和核心启动子之间距离的前提下,将DNA弯曲蛋白CopG的靶位点替换插入到两者之间的不同位置,构建了一系列的同源启动子.在大肠杆菌中,这些同源启动子的活性被CopG介导的DNA弯曲激活或者被抑制.不同位置的CopG靶位点,在具有相同调控模式的同源启动子中(无论是激活还是抑制)相距为整数个螺旋,在具有相反调控模式的同源启动子中相距为整数加半个螺旋.我们的实验结果表明,CopG介导的DNA弯曲可能通过改变σ54RNA聚合酶和NtrC在DNA螺旋上的相对相位关系进而可以调控σ54依赖型启动子的转录起始.

葡萄糖调节蛋白78研究进展

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78kD,GRP78)又称免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是位于内质网上重要的分子伴侣,属热休克蛋白70家族的一员,GRP78分子及其DNA分子序列结构在许多生物物种中高度保守。GRP78在内质网中参与阻止内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡,以及启动未折叠蛋白反应等细胞生命过程。GRP78基因启动子上存在内质网应激反应元件(ERSE)和cAMP反应元件(CRE)等特殊的顺式作用元件,特异性转录因子ATF6等与GRP78启动子上顺式作用元件发生动态结合,从而调节GRP78基础性或诱导性转录表达。近年来发现,GRP78与脂肪肝、肿瘤和神经系统等疾病的发生发展密切相关,GRP78生物学功能的研究已经引起生物学家们的广泛重视。