基于光热纳米材料的热信号侧向层析技术研究进展

侧向层析检测(LFA)由于简单、快速、便携、成本低廉等优势在疾病快速诊断筛查领域得到了广泛应用。然而,随着医学检验的发展,传统的LFA越来越难以满足其对高灵敏度检测的需求。许多新型功能纳米材料已被引入LFA作为信号标签来实现其高灵敏度检测,其中基于光热纳米材料的热信号LFA技术具有信号稳定、可探测检测线内所有标签信号、成本低、灵敏度较高等优势,近年来得到了快速的发展。建立热信号LFA的核心问题是用于热信号标签的理想光热纳米材料的开发与应用。本文介绍了光热效应的机制和几种典型光热纳米材料的性能特点,然后综述了近年来基于光热纳米材料构建的热信号LFA及其读卡设备设计开发的研究进展,最后总结了热信号标签材料的评价标准和LFA读卡设备开发改进的方向。希望本文的系统介绍可以助力基于光热纳米材料的热信号LFA技术的未来发展。

猪伪狂犬病毒gB抗原侧向层析快速检测试纸条的研制

为建立一种简便、快速、特异的猪伪狂犬病毒(PRV)gB抗原检测方法,利用单克隆抗体技术和侧向层析(LFA)技术,采用柠檬酸三钠还原法,制备颗粒大小为31.5 nm胶体金,再用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体10D4,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处,分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体6E9,组装成LFA方法通用胶体金层析试纸条。经测试,该试纸条最低能检测出1:640倍稀释的,TCID_(50)为1×10^(8.6)/0.1 mL的灭活PRV抗原,并与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无交叉反应,特异性良好;室温干燥密闭的条件下,该试纸条至少可保存10个月。结果表明,本研究建立的试纸条方法操作简单、快速、敏感、特异,易于判定,适合基层PRV的大面积普查和现场检测。

侧向层析免疫试纸法快速检测蔬菜中的腐霉利

目的建立基于胶体金标记的侧向层析免疫试纸快速检测新技术检测多种蔬菜中腐霉利的分析方法。方法利用喷膜仪以0.5μL/cm的喷速将1 mg/mL的羊抗鼠抗体、1 mg/mL的腐霉利包被原喷到NC膜上。再通过静电吸附的方式将腐霉利单克隆抗体标记到胶体金表面,制备成偶联物滴加到标记垫上。最后依次将样品垫,标记垫、划好的NC膜以及吸水垫粘贴到底板上,两者之间均有2 mm的重叠,使标记垫处于样品垫之下、NC膜之上的位置,组装好完整的试纸条,测试过程中在样品垫上滴加样品,观察C、T线位置显线情况进行判定。结果该方法不受蔬菜中本身复杂成分以及背景颜色的影响,能够对蔬菜中腐霉利进行特异性识别鉴定, 10 min便可获得检测结果。结论该方法测试的结果与仪器法检测结果一致,检测灵敏度满足国标限量要求。

绵羊肺炎支原体降落PCR-侧向层析快速检测方法的建立

为建立一种简易、快速、特异性强的绵羊肺炎支原体(Mo)检测方法,本研究结合降落PCR(TD PCR)和侧向层析(LFA)技术,采用40nm的胶体金标记抗地高辛抗体,检测线和质控线分别包被链霉亲和素和羊抗鼠IgG,组装成LFA方法通用胶体金层析试纸条。两条特异性引物5'端分别标记地高辛和生物素,以Mo的全基因组为模板进行降落PCR,产物滴加于试纸条上样垫,检测结果可在15min内读取。通过对各环节的调整优化,建立了检测Mo病原的TD PCR-LFA快速检测方法。结果显示:该方法仅对MO检测呈阳性,对其它病原菌检测均为阴性,表明该方法特异性良好。其检测下限为3×102ccu/mL,敏感性较强。不同批次的PCR产物、不同批次的试纸条读取结果均一致,表明重复性和稳定性较好。本研究建立的Mo检测方法整合了TD PCR的特异性、敏感性和金标条快速、简单的特性,在2h内可完成检测,为建立适用于基层的临床检测方法奠定了基础。

基于侧向层析原理的赭曲霉毒素A快速检测试纸条的研制

针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。利用胶体金与赭曲霉毒素A单抗偶联物和赭曲霉毒素A-BSA偶联物(OTA-BSA),开发了一种快速检测赭曲霉毒素A的方法。研究结果表明:1当OTA-BSA配制终质量浓度为4.8 g·L^(-1),质控线用羊抗鼠IgG配制终质量浓度为1.5 g·L^(-1),硝酸纤维素(NC)膜的包被量为1.0μL·cm^(-1)时呈现最清晰、最均匀的条带。2赭曲霉毒素A胶体金快速检测试纸条的灵敏度达到1.0μg·L^(-1),检测时间仅为5 min,非常适合现场快速检测。该检测试纸条具有携带方便、灵敏度高、特异性强等优点。由于本方法检测时间短,灵敏度高,与传统的仪器和酶联免疫检测方法相比,在野外和临床检测中更具有推广应用价值。

基于分子发夹/荧光微球的侧向层析法定量检测黄曲霉毒素B1

基于分子发夹/荧光微球探针构建了一种侧向层析定量检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的新方法。一条含有AFB1适配体的分子发夹与荧光微球偶联后,形成的标记探针被喷涂在试纸条的结合垫上。一条5'端含有链霉亲和素的寡核苷酸序列包被在硝酸纤维素膜的检测线上,另一条包含有AFB1适配体互补链的寡核苷酸序列包被在硝酸纤维素膜的质控线上。当待测样本中含有AFB1时,AFB1先与标记物结合垫处标记探针中的AFB1适配体结合,同时,标记探针中的DNA分子发夹‘茎’的双链被打开,AFB1与标记探针形成的复合物层析到反应膜的检测区时,被检测区的寡核苷酸序列捕获,检测区出现亮线。利用该原理,通过一个"off-on"的光信号,实现了对AFB1的高灵敏检测。实验结果表明,AFB1在0.1~50μg/L质量浓度范围内,检测线处的荧光强度(T)和质控线荧光强度(C)的比值与AFB1质量浓度呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)达0.05μg/L,且具有很高特异性,可实现对实际样品中AFB1的准确检测。

基于适配体胶体金侧向层析试纸快速检测卡那霉素的方法研究

该文基于适配体以及非巯基化核酸修饰的胶体金纳米探针(AuNPs@polyA-DNA),建立了一种新型的卡那霉素胶体金侧向层析试纸条。分析了试纸条各组装元件,包括适配体浓度、链霉亲和素(SA)与Biotin-DNAT的比例、SA-生物素(Biotin)-DNAT偶联物浓度以及孵育时间与温度等,对显色反应的影响。最佳实验条件为:缓冲液为4xSSC(0.5%Tween 20),SA与Biotin-DNAT的最佳摩尔比为1∶6,检测区喷涂偶联物SA-Biotin-DNAT浓度为4μmol/L,适配体浓度为10 nmol/L,室温孵育时间为20 min。在优化条件下,该试纸条对卡那霉素的肉眼分辨浓度为25 ng/mL,线性范围为5.0~125 ng/mL,检出限为1.5 ng/mL。用于蜂蜜中卡那霉素的检测,其回收率为95.1%~105%,相对标准偏差(RSD)为3.4%~8.5%。该试纸条具有灵敏度高、特异性好、架构简单、重复性高等优点,可用于实际样品中卡那霉素的检测。

侧向层析免疫诊断试剂信号放大的方法

传统的侧向层析免疫诊断试剂(LFI,lateral flow immunoassay)具有快速、便宜、操作简便等特点。但是检测灵敏度相对于ELISA,免疫荧光,化学发光等检测试剂较低。为提高传统LFI的检测灵敏度,研究者开发了多种方法。本文讨论了常用的几种方法,并且对各自的优缺点进行了阐述。

侧向层析试纸条现场检测牛奶中黄曲霉毒素M1

文章研究了一种可用于现场快速检测牛奶中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的方法,经测试该方法不需要任何的样品前处理,测试结果不受牛奶基质的影响。该实验分别在标准样品及牛奶样品中建立了线性方程,显示线性良好。测试结果表明AFM1快速检测试纸条的检测限为0.05μg/L,检测时间为10 min。该方法准确可靠,使用简单快捷,可用于大量样品的现场检测。

基于核酸等温扩增与侧向层析试纸联用鉴定黑胡椒调味品的真实性

本研究以黑胡椒中木瓜籽掺假为代表性研究对象,开发了一种分子扩增与侧向流动层析(LFA)联用方法,通过整合重组酶聚合酶链式扩增反应(RPA)和LFA技术,实现了对黑胡椒样品中木瓜籽掺假的敏感快速检测。该方法的检出限(LOD)为0.1%,整个检测过程可以在40 min内完成,适用于现场测试,并成功用于鉴定香料黑胡椒的真实性。

基于多酶恒温快速扩增-侧向流层析联用技术的肉制品真实性研究

目的:基于多酶恒温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)与封闭式侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)联用技术,建立肉制品真实性快速检测方法,解决实验室方法不适于基层与现场快检需求的问题。方法:通过GenBank筛选猪、牛、羊、鸡、鸭线粒体基因的特异序列,使用DNAStar Megalign软件比对种内保守、种间特异的靶片段,依据MIRA引物探针设计原则设计靶基因引物探针组,通过阳性对照、阴性对照、空白对照等方式系统筛选引物探针,确定猪、牛、羊、鸡、鸭的专属性引物探针,并采用反应体系、反应温度、反应时间筛选,优化完善特异性检测方法。对方法进行系统的方法学考察,包括DNA提取、灵敏度、检出限、假阳性与假阴性考察等,验证方法的有效性。结果:使用建立的方法与实时荧光聚合酶链式反应检测进行比对分析,方法的平均假阳性率为3.49%、假阴性率为3.54%,符合现场快检方法的要求。结论:本研究建立了牛、羊、猪、鸡、鸭5种常见肉类的MIRA-LFD技术,并证实了其有效性和可行性,实现了肉制品真实性的现场快检。

侧向层析法检测隐球菌荚膜多糖抗原在隐球菌感染诊断中的临床价值

目的了解隐球菌荚膜多糖抗原侧向层析法在临床检出隐球菌感染所致疾病的性能,为临床筛查隐球菌感染选择检验项目提供更好依据。方法收集四川大学华西医院2018年送检隐球菌荚膜多糖抗原病例资料。分析侧向层析法检测患者隐球菌荚膜多糖抗原对隐球菌感染所致疾病的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。对侧向层析法检出阳性并有明确临床诊断的样本与该例患者送检的墨汁染色法、真菌培养法结果进行比较分析。结果共检测721例。侧向层析法检测荚膜多糖抗原诊断隐球菌感染的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为100.00%、99.39%、93.93%、100.00%;墨汁染色法、真菌培养法及侧向层析法检测隐球菌感染的阳性率分别是63.46%、48.00%、100.00%。62例患者已明确临床诊断,其中隐球菌性脑膜炎45例(72.58%),隐球菌肺炎16例(25.81%),骨隐球菌感染1例(1.61%)。结论隐球菌荚膜多糖抗原-侧向层析法在检出隐球菌感染所致疾病中敏感性和特异性均较高,对临床早期筛查及辅助诊断隐球菌感染有较好临床应用价值,且操作快速简便,对检测人员的经验要求不高,适合各等级医院开展。

侧向层析技术标记物研究进展

侧向层析技术以其简单、快速、灵敏、经济等优势广泛应用于即时检验、现场检验以及家庭自检中。合适的标记物的选择对整个实验的灵敏度起着重要作用。传统的标记物有胶体金、纳米硒以及纳米碳等,尤以胶体金最为常用。近年来新型标记物的出现,如量子点、纳米酶等,使得侧向层析有了进一步的发展,实现了从定性检测逐步向定量检测的转变。本文旨在介绍目前已有的侧向层析标记物,为侧向层析工作者筛选合适的标记物提供一定的研究依据。

早期香蕉枯萎病Foc4双探针核酸纸基检测传感器研制

为实现对早期香蕉枯萎病4号生理小种(fusarium oxysporum f.sp.cubense 4, Foc4)的准确检测,该研究提出一种基于胶体金的双探针纸基传感器。该传感器将2种不同粒径的胶体金分别与检测探针和信号增强探针结合,利用DNA探针代替抗原和抗体,形成双探针体系,通过增加信号增强探针降低检测限。基于目标序列与双探针体系的碱基互补配对形成“金标探针-目标序列-T线探针”复合物并在传感器的测试区被捕获,10 min内形成肉眼可见的目标产物,通过分析测试条带得到光强度峰面积并代入标准曲线中,实现Foc4定量检测。试验结果表明,双探针纸基传感器的检测限达到0.001 nmol/L,是传统纸基传感器的100倍,提高了检测灵敏度;在0.001~1 000.000 nmol/L范围内,Foc4浓度与测试线光强度峰面积呈线性关系;使用高浓度非互补探针进行试验干扰,发现非互补序列对检测效果基本无影响,表明该传感器具有较好的特异性;香蕉叶片Foc4检测的平均回收率为77.6%~102.3%,相对标准偏差为7.4%~7.7%。与传统形态学观察等检测方法相比,该研究提出的双探针核酸纸基检测传感器可以及时、快速、准确地判断早期Foc4的存在,具有良好的推广性和实际应用价值。

猫杯状病毒RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法的建立及初步应用

为建立猫杯状病毒(FCV)基于重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)结合CRISPR-Cas12a系统及侧向流层析试纸条(LFS)(RAA-CRISPR/Cas12a-LFS)的快速检测的方法,本研究基于FCV衣壳蛋白(VP1)基因序列保守区设计RAA引物、4对针对VP1靶标的扩增引物、4对VP1-cr RNA扩增引物和1条报告探针。利用4对VP1-crRNA扩增引物经退火和T7 RNA聚合酶转录合成4条靶标crRNA:VP1-1/2/3/4-crRNA,利用4对VP1靶标扩增引物经退火合成4条靶标双链DNA:VP1-1/2/3/4,经EnGen Lba Cas12a (Cpf1)核酸酶试剂的切割反应和Cas12a试纸条检测,根据出现条带的强弱筛选最佳VP1-crRNA。结果显示,VP1-2-crRNA对应的T线条带最强且C线不完全切割的条带最弱。因此选择VP1-2-crRNA进行后续试验。分别以FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA为模板,利用RAA引物扩增其VP1基因,并通过琼脂糖凝胶电泳检测并评估RAA引物的扩增效果;利用Cas12a (Cpf1)核酸酶,以上述RAA扩增的VP1基因(来自FCV VR-782株RNA)为模板,在37℃恒温水浴30 min进行CRISPR/Cas12a-LFS检测,评估RAA产物、Cas12a、VP1-2-crRNA和ss DNA报告基团对CRISPR/Cas12a-LFS检测体系的重要性。RAA扩增效果的评估结果显示,从FCV VR-782株及6株分离的FCV RNA中均扩增到282 bp的VP1基因目的条带。重要性评估结果显示,只有上述4种试剂全部存在时CRISPR/Cas12a-LFS检测体系才能有效扩增。利用该方法检测FCV、猫疱疹病毒I型、支气管败血波氏菌、猫细小病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、F81细胞,结果显示,该方法仅能够特异性检测FCV,而其他病原的检测结果 均为阴性,且分别在42℃30 min内和37℃40 min内完成对FCV的RAA扩增及CRISPR/Cas12a-LFS检测;利用该方法检测10倍倍比稀释的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1以评估其敏感性,结果显示,该方法的检测限为37.5拷贝/μL,与本研究室建立的Taq Man荧光定量PCR方法的敏感性相当;分别利用同一批次和3批次配置的RAA-CRISPR/Cas12a-LFS体系分别检测不同浓度的重组质粒标准品p MD18T-FCV-VP1,以评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性检测结果均一致;利用该方法和Taq Man荧光定量PCR方法同时检测临床采集的76份猫呼吸道拭子样品。结果显示,该方法检测到37份FCV阳性样品,39份阴性样品;Taq Man荧光定量PCR检测到36份FCV阳性样品,40份阴性样品。二者的阳性符合率达97.30%,阴性符合率97.50%,总符合率98.68%。本研究初步建立的FCV RAA-CRISPR/Cas12a-LFS检测方法简单、快速,且特异性强、敏感性高、重复性好、不依赖昂贵设备,为现场FCV的检测提供新的技术手段。

应用于RPA nfo反应产物结果可视化的胶体金试纸条制备与评价

旨在利用6-羧基荧光素(6-FAM)与6-FAM单克隆抗体、生物素与链霉亲和素之间的特异性结合,制备可用于nfo酶切割探针的重组酶聚合酶(RPA)反应产物结果可视化的胶体金侧向免疫层析试纸条(GICS)。通过杂交瘤法和诱生腹水法制备了高亲和力的6-FAM单克隆抗体(亲和力常数为5.38×10~9 L/mol),再运用高浓度NaCl破坏试验,确定了胶体金与6-FAM抗体的最佳标记pH值为8.0,最佳抗体标记量为12μg/mL,并使用模拟样本确定了最佳检测(T)线包被缓冲液为0.2 mol/L(pH值5.0)。然后使用RPA nfo反应产物作为实际样本,观察条带的深浅,最终确定在层析液为0.1 mol/L PB(pH值7.4)、T线包被1 mg/mL SA、反应液用量5μL及金标抗体用量10μL条件下,能实现试纸条最佳检测性能。自主研发的胶体金侧向免疫层析试纸条在加样5 min后能出现清晰的条带,与目前商品化试纸条的可视化判定结果一致,能替代现有的商品化试纸条,降低检测成本、缩短检测时间,对建立RPA nfo-GICS及RPA-CRISPR Cas12a-GICS检测方法奠定了基础。

指纹汗液中吗啡的现场快速检测方法

本研究以经典的胶体金免疫侧向层析技术为基础,使用合理设计的加宽型试纸条直接采集指纹汗液,开发了一种简单、快速、便捷、可现场检测指纹汗液中吗啡的侧向层析试纸。对层析试纸制备过程中一系列影响检测灵敏度以及稳定性的参数优化后,设计的方法能够实现不需经过任何复杂的预处理,即可在10 min内通过指纹汗液检测出目标物吗啡,且其可视化灵敏度可低至20 pg,检测限为3.9 pg。研究结果表明,所建立的侧向免疫层析检测技术特异性良好,与同类型常见的其它毒品无交叉反应,可以成功应用于吸毒者快速、准确的现场筛查,适用于缉毒工作者的现场稽查。

向日葵黑茎病菌RPA/CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

向日葵黑茎病菌是向日葵上的一种毁灭性真菌,是我国的植物检疫性有害生物。为了准确快速检测向日葵黑茎病菌,本研究根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计特异性RPA引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立了RPA等温扩增技术结合CRISPR-Cas12a检测的快速检测方法。通过条件优化,RPA/CRISPR-Cas12a检测体系在37℃恒温条件下,RPA反应30 min,CRISPR/Cas12a反应20 min,即可特异性检测向日葵黑茎病菌。荧光法检测灵敏度与实时荧光PCR的灵敏度相当,最低检测量为0.1 pg,试纸条法检测最低检测量为1 pg。由于试纸条检测结果可用肉眼观察,快速便携,操作简单,更适合用于田间和口岸的向日葵黑茎病菌快速早期检测;而荧光检测灵敏度高,对环境要求高,更适合用于实验室检测。

3种方法检测艾滋病患者血和脑脊液中隐球菌的结果分析

目的比较真菌培养、墨汁染色、侧向免疫层析法(LFA)检测艾滋病患者脑脊液和血标本中隐球菌的阳性率差异,以期为临床医生提供隐球菌感染理想的检测方法。方法采用回顾性分析,收集2017年本院就诊的1 049例AIDS患者的血液和脑脊液标本,进行真菌培养、侧向免疫层析法和脑脊液墨汁染色。数据分析应用SPSS 14.0软件。结果 1 049例AIDS患者,其血培养、隐球菌抗原检测、脑脊液培养和墨汁染色阳性率分别为2.8%(19/688)、10.96%(115/1 049)、9.18%(29/316)、17.99%(59/328),其中201例患者同时做了脑脊液和血标本的隐球菌抗原检测,阳性率分别为27.86%和37.31%,差异有统计学意义(P<0.05)。292例AIDS患者同时做了脑脊液的墨汁染色和隐球菌抗原检测,阳性率分别为19.52%和23.97%,隐球菌抗原检测的阳性率大于墨汁染色法,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 3种方法检测结果显示侧向免疫层析法阳性率最高,比较脑脊液和血标本侧向免疫层析法阳性率,血标本阳性率较高,所以血标本侧向免疫层析法检测是诊断AIDS是否合并隐球菌感染的理想方法之一。

基于铈元素的荧光侧向液流免疫层析用于降钙素原测定

基于铈元素(Ce)的荧光侧向液流免疫层析(lateral-flow immunoassays,LFIA)技术,开发一种用时短、检测限低的方法,定量测定降钙素原(procalcitonin,PCT),以满足临床检测和诊断的需求。经反向微乳化、氨基修饰、包被Ce,合成Ce微球;其经活化、洗涤,用PCT抗体标记结合和封闭制备微球悬浮剂,固化液相、固定包被和质控抗体、组装和切割等步骤制备PCT试纸条,检测PCT标准品;通过精密度、正确度、回收率、交叉反应和热稳定实验分析该PCT试纸条的临床价值。实验结果显示:用1%含量的Ce微球、100μg标记抗体、Blockmaster TM CE510封闭剂制备的PCT试纸条,采用LFIA法检测PCT,仅需4 min完成检测,大大缩短实验时间;检测限达0.10μg/L;且无边缘和钩状效应、交叉反应;成本低、精密度和准确度高、回收率佳、热稳定性好。因此,本实验基于Ce的LFIA法,成功研发了一种快速、灵敏的PCT床旁定量检测。