适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。

鲤浮肿病毒RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测鲤浮肿病毒(CEV)的方法,本研究联合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RAA下游引物和探针的5’端分别进行Biotin和FAM标记,通过RAA反应时间和温度等条件的优化,建立了可用于CEV现地检测的RAA-LFD方法。该检测方法在34℃~40℃恒温反应10 min即可实现对CEV目的基因片段的有效扩增;与其它常见水生动物疫病病原DNA无交叉反应;RAA扩增产物可以直接对LFD经肉眼观察结果,该方法对标准质粒pEASY-CEVP4a的最低检测限为6拷贝/μL,与荧光定量PCR灵敏度相当;组内和组间重复性试验表明该方法具有良好的重复性和稳定性;采用该方法和荧光定量PCR对60份临床样本同时进行检测,二者的阳性符合率为96.08%。本研究建立的RAA-LFD检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方便,可用于CEV的临床快速检测。

鲤疱疹病毒Ⅱ型RAA-LFD检测方法的建立

为了建立一种简便、快捷的现地检测鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的方法,本文联合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RAA下游引物和探针的5’端分别进行生物素(Biotin)和荧光(FAM)标记,通过对RAA反应时间和温度等条件的优化,建立了可用于现地检测CyHV-2的RAA-LFD方法。该检测方法在34℃~40℃恒温下反应10 min即可实现对CyHV-2目的基因片段的有效扩增,与其他常见水生动物疫病病原脱氧核糖核酸(DNA)无交叉反应,RAA扩增产物可直接用LFD肉眼观察,对标准质粒pUC57-CyHV-2的最低检测限为8拷贝/μL,比普通聚合酶链式反应(PCR)灵敏度高出10倍。组内和组间重复性试验表明该方法有良好的重复性和稳定性,使用该方法对45份临床样本进行检测,与普通PCR结果符合率为95%。本文建立的RAA-LFD检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方便,可用于CyHV-2的临床快速检测。

基于PCR和LFS技术的掺假豌豆成分快速检测

文章运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和侧向流试纸条(lateral flow strip,LFS)相结合方法,以豌豆特异性基因为参照对绿豆食品中掺入豌豆成分进行定性分析。实验对退火温度、修饰引物浓度和镁离子浓度进行优化,并在最优PCR条件下进行特异性和灵敏度检测。结果表明,在退火温度为59℃,修饰引物加入量为0.20μmol/L,镁离子加入量为1.75 mmol/L条件下,PCR扩增效果最好,掺假检测限为0.5%,最低可检测豌豆DNA量为0.12 ng。该方法特异性高、操作简单快速,依靠视觉观察就能得出定性结果。