重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。

LAMP耦合荧光侧向流层析试纸条的空间微生物快速检测技术

微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环境影响的优点,耦合荧光检测方法可以达到较高的检测灵敏度,是在轨微生物检测的潜在方法之一。针对空间环境中对航天员生活环境及仪器仪表设备具有潜在危害的微生物,研究了一种基于环介导等温扩增(LAMP)耦合荧光侧流层析试纸条的微生物核酸鉴别技术。研究结果表明,该技术可实现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等空间站常见有害微生物的高灵敏、高特异性、快速检测,检测时间小于60 min,灵敏度达到100 copy·μL^(–1)。

芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。

基于重组酶介导等温扩增-侧流层析试纸条的玉米褪绿斑驳病毒快速检测方法

为快速和现场检测玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV),根据MCMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将一步法反转录重组酶介导的等温扩增(one-step reverse transcript recombinase-aid amplification,RT-RAA)技术与侧流层析试纸条(lateral flow assay,LFA)结合建立一种快速检测MCMV的方法,对该方法的探针浓度、反应温度和反应时间进行优化,并对优化后方法的特异性和灵敏度进行检测。结果表明,该检测方法的最佳探针浓度为0.02μmol/L,最佳反应温度为37℃,最佳反应时间为8 min;该检测方法的特异性强且对MCMV RNA的检测灵敏度为8.6×10^(-6) ng/μL,比常规RT-PCR方法的灵敏度提高10倍,对MCMV CP质粒DNA拷贝数的检测灵敏度为92.5 copies/μL,比常规RT-PCR方法的灵敏度提高10倍;该检测方法用时短,约13 min,其中RT-RAA仅需8 min,LFA仅需5 min,且操作简单,可用于MCMV的实时监测及病害的田间快速诊断。

李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立

根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。

动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术的B、E型腺病毒快速可视化检测方法的研究与评价

目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测技术,评价其灵敏度与特异性,并验证最佳反应温度与反应时间,同时利用该法对19例B、E型腺病毒感染患者及10例健康志愿者鼻咽拭子标本进行检测。结果腺病毒LFD-RPA法检测灵敏度可达10拷贝/μl,与q PCR方法相近,且不会与其他亚属腺病毒及其他病毒发生交叉反应。反应可在25~45℃温度范围内高效进行,检测全程仅需15~20 min。利用临床咽拭子标本对检测体系进行评估,其灵敏度及特异性均达100%。结论该检测方法灵敏度高、特异性强、操作简单,反应快速,能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖,在基层卫生部门,尤其在野外及现场检测中具有极大的应用潜力。

柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。

烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。

柑橘黄龙病RAA-LFD检测方法的建立

本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件的优化,建立了柑橘黄龙病菌RAA-LFD检测方法。该方法可快速高效地完成柑橘黄龙病菌检测,灵敏度可达到10 copies/μL;特异性试验结果显示,除柑橘黄龙病菌基因组呈阳性外,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、沙门氏菌均为阴性,特异性良好。利用该方法检测102份柑橘叶样本,结果显示,56份样本核酸为阳性,46份样本核酸为阴性;与荧光定量PCR法、RAA荧光法比较,RAA-LFD检测法弱阳的检出率偏低,但是RAA-LFD检测法摆脱了仪器依赖,操作更简便快速,无需电泳检测,避免了核酸扩增产物开盖污染的风险,适用于柑橘黄龙病菌的快速检测,适合在基层使用。

布鲁氏菌RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella)Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性检测。结果显示该检测方法在39℃反应20 min以上便可肉眼观察到明显结果。特异性试验结果显示除布鲁氏菌基因组呈阳性外,维氏气单胞菌、大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到101拷贝/μL的质粒标准品,比常规PCR高出100倍,敏感性较高;重复性试验结果显示,3次批间重复试验无明显差异,稳定性良好。利用该方法检测34份临床样品,其检测结果与普通PCR检测结果符合率为100%。本研究建立了一种快速检测布鲁氏菌的方法,该方法不需要特殊的仪器,操作简便,灵敏度高,肉眼即可观察到结果,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示:猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^(-1),优于常规PCR方法,且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围(30~45℃)内高效进行,20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估,其检出率高于细菌分离与常规PCR方法,具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点,同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于野外及现场检测。

金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用

靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速检测方法。该方法在引物浓度200 nmol/L、33℃反应20 min即可实现靶标基因片段的有效扩增。特异性分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌与其他常见致病菌菌株间不存在交叉反应,灵敏度分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌的检出限为4 fg/μL(DNA)与1.83×10^(2) CFU/mL(纯菌液)。用人工污染牛奶样品验证RAA-LFD方法的可靠性,结果显示在增菌6 h时,RAA-LFD方法可检测到1.83×10^(1) CFU/mL金黄色葡萄球菌。分别采用微生物生化鉴定法、PCR法与RAA-LFD方法对64份牛奶样品进行金黄色葡萄球菌检测,结果表明,RAA-LFD方法与微生物生化鉴定法总符合率为95.3%,与PCR法总符合率(98.4%)表现出较高的一致性。本研究建立的可视化检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单、检测结果直观、对仪器设备要求低等特点,为牛奶中金黄色葡萄球菌的检测提供新的发展方向。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征RPA-LFD诊断方法的建立及初步应用

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)给我国养猪业带来了巨大的损失.为快速、便捷诊断该病,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)的HP-PRRS诊断方法.针对HP-PRRSV Nsp2基因特异序列,设计生物素(Biotin)标记的特异性引物和FAM荧光素标记的探针,对RPA-LFD的反应体系和条件进行优化,结果显示,HP-PRRSV RPA-LFD最佳反应体系为:上下游引物(0.42 pmol/μL)各2.1μL,探针(0.3 pmol/μL)0.6μL,Rehydration buffer 29.5μL,cDNA模板1μL,ddH_(2)O 12.2μL,MgOAc 2.5μL,共50μL;最佳反应条件为:37℃,20 min.该方法同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332株(PRRSV VR2332)和NADC30-like株等10种常见感染猪的病原,结果显示,该方法除对HP-PRRSV检测呈阳性外,对PRRSV VR2332株、NADC30-like和其它9种感染猪的病原检测均为阴性,特异性强;该方法对10倍系列稀释的质粒标准品检测结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为4.05×10^(1)拷贝/μL,灵敏度高;该方法与HP-PRRSV商品化荧光检测试剂盒同时检测50份临床样品,二者符合率为100%.本研究首次建立了一种特异、灵敏、方便、快速、现场化的HP-PRRSV RPA-LFD检测方法,为HP-PRRS的快速诊断和流行病学调查提供了新的技术手段.

基于猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2a基因的RT-RAA-LF检测方法的建立

本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2a基因序列,设计特异性RAA引物和标记探针,通过反转录酶与重组酶扩增结合,旨在建立一种高效检测PRRSV的基于侧流层析试纸条的可视化RT-RAA方法。结果,建立的RT-RAA-LF方法的最佳反应条件是39℃恒温扩增10 min,可在2 min内实现对检测结果的可视化判定;该方法特异性强,仅对PRRSV出现阳性扩增,对本研究中其他病原均无交叉反应;以含PRRSV ORF2a基因全段序列的重组质粒作为模板,RT-RAA-LF的检出限为160 copies/μL。应用建立的RT-RAA-LF方法对临床采集的160份样本进行检测,与PCR方法进行比较,两种方法的符合率为96.8%(65/68),一致性检验为χ2<3.84,在95%的置信区间内没有显著性差异,当中3份临床样品在PCR检测中为阴性。综上,基于PRRSV ORF2a建立的RT-RAA-LF方法操作简单,对仪器设备要求不高,能够高效且直观的实现临床检测,满足现场检测的要求,对猪养殖场快速诊断和防控PRRSV具有重要意义。

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL-1,略低于常规PCR(10 fg·μL-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。

马铃薯腐烂茎线虫RPA-LFD可视化快速检测方法的建立

马铃薯腐烂茎线虫是为害我国甘薯和马铃薯的一种重要植物病原线虫,也是我国重要的检疫性有害生物。为实现对该线虫的准确、快速且可视化的检测,本研究以马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列为靶标构建了重组酶聚合酶结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)的可视化快速检测体系。该体系可在39℃条件下15 min内特异性地完成对马铃薯腐烂茎线虫的检测,对A型(甘薯种群)和B型(马铃薯种群)单头线虫(J4)的检出底限均为3125-1头线虫,可以直接对土壤和甘薯茎中的马铃薯腐烂茎线虫进行检测,灵敏度可达1头(J4)/10 g土壤和1头(J4)/2 g甘薯茎组织。该体系操作简便、成本低廉、结果可视,可为马铃薯腐烂茎线虫的早期预警和口岸检疫提供技术支撑。

基于RPA-LFD的日本血吸虫循环核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价

目的结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值。方法以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测模板量为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性。制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清。用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清。提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值。结果建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30~45℃反应10 min即可检出目的片段。RPA最优反应条件为39℃,20 min。RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10^-6ng(1 fg)。特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性。RPA-LFD方法可成功检出含0.01~100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段。结论建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值。

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10^2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10~20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。