重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

神奇的农残检测试纸条——用于有机磷农药残留检测的核酸适配体侧流层析试纸条

有机磷农药是农业生产中使用最广泛的农药之一,其大量使用造成了农作物表面、水体和土壤等环境中的农药残留,严重破坏生态环境,威胁人体健康。因此,快速、准确地检测环境中的有机磷农药残留对于控制农药使用和污染具有重要意义。传统色谱、光谱检测方法依赖于大型仪器和专业的技术人员,存在检测成本高、耗时长等缺点。因此,本文创新性地制备了一种基于核酸适配体的胶体金侧流层析试纸条,用于果蔬中有机磷农药残留的快速和准确检测。由于该试纸条具有灵敏、便携、易于操作的优点,能现场应用在实际的蔬菜样品检测中,具有很好的科普性和可推广性。另外,本科普实验操作过程逻辑清晰、内容详实,并且针对不同类别的人群,设计多样化的实验过程和实验方案,能够很好地激发大家对化学的兴趣和提升对食品安全的意识。

LAMP耦合荧光侧向流层析试纸条的空间微生物快速检测技术

微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环境影响的优点,耦合荧光检测方法可以达到较高的检测灵敏度,是在轨微生物检测的潜在方法之一。针对空间环境中对航天员生活环境及仪器仪表设备具有潜在危害的微生物,研究了一种基于环介导等温扩增(LAMP)耦合荧光侧流层析试纸条的微生物核酸鉴别技术。研究结果表明,该技术可实现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等空间站常见有害微生物的高灵敏、高特异性、快速检测,检测时间小于60 min,灵敏度达到100 copy·μL^(–1)。

重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。

芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为建立芋疫霉Phytophthora colocasiae快速准确的分子检测方法,基于Ypt1基因特异序列,设计芋疫霉的特异性引物与探针,建立一种快速、准确、可视化的芋疫霉重组聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测方法,对该检测方法进行优化,评估其特异性与灵敏度,并对田间疑似样品进行检测。结果表明,优化后的芋疫霉LFD-RPA检测方法最适反应条件为39℃恒温反应30 min。LFD-RPA检测方法能够特异性地检测出芋疫霉,而对其他卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检出,且该检测方法对芋疫霉DNA的检测灵敏度达到1 pg/μL。对田间带病组织检测发现,LFD-RPA检测方法能够快速准确地从田间自然发病植株中检测出芋疫霉。表明本研究所建立的芋疫霉LFD-RPA快速可视化检测方法特异性好、灵敏度高、简单快捷,可用于芋疫病的田间快速诊断。

基于重组酶介导等温扩增-侧流层析试纸条的玉米褪绿斑驳病毒快速检测方法

为快速和现场检测玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV),根据MCMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将一步法反转录重组酶介导的等温扩增(one-step reverse transcript recombinase-aid amplification,RT-RAA)技术与侧流层析试纸条(lateral flow assay,LFA)结合建立一种快速检测MCMV的方法,对该方法的探针浓度、反应温度和反应时间进行优化,并对优化后方法的特异性和灵敏度进行检测。结果表明,该检测方法的最佳探针浓度为0.02μmol/L,最佳反应温度为37℃,最佳反应时间为8 min;该检测方法的特异性强且对MCMV RNA的检测灵敏度为8.6×10^(-6) ng/μL,比常规RT-PCR方法的灵敏度提高10倍,对MCMV CP质粒DNA拷贝数的检测灵敏度为92.5 copies/μL,比常规RT-PCR方法的灵敏度提高10倍;该检测方法用时短,约13 min,其中RT-RAA仅需8 min,LFA仅需5 min,且操作简单,可用于MCMV的实时监测及病害的田间快速诊断。

动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。

李矮缩病毒重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条检测方法的建立

根据李矮缩病毒(prunedwarfvirus,PDV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立了PDV的重组酶聚合酶扩增—侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick,RPA-LFD)检测方法。该方法在恒温39℃下反应20 min,具有标记的扩增子可达到检测水平。扩增子检测室(amplicon detection champer)中的侧流层析试纸条在20 min内呈现可视化检测结果。该方法与侵染樱桃的另外6种病毒(CGRMV、PNRSV、Lch V-1、PBNSPa V、CVA和CNRMV)无交叉反应。灵敏度试验表明,用RPA-LFD方法检测PDV的灵敏性是PCR方法的10倍。用该方法检测13个田间样品,其检测结果与PCR检测结果一致。RPA-LFD法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强等特点,适合对PDV样品的快速检测与鉴定。

RAA-LFD检测RHdV-2方法的建立

【目的】建立基于重组酶介导的核酸等温扩增(RAA)的侧流层析试纸条(LFD)方法,用于快速诊断兔出血症病毒(RHdV)2型(RHdV-2)。【方法】采用生物信息学软件分析RHdV-2、RHdV 1型(RHdV^(-1))基因组,筛选RHdV-2特异且保守的片段,设计RAA-LFD探针与特异性引物,以筛选最适引物及其浓度;对RAA-LFD检测的最适反应温度和时间进行优化,并对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价及临床样品检测。【结果】同源性分析表明,RHdV-2的VP60基因存在特异且保守的序列。基于VP60基因设计3对引物,发现上游引物序列为5'-TCATTTGTACCCTTCAGCGGTACCACCATCC-3'、下游引物序列为5'-CCCGGCTGTTGTCTGGTTTATGCCATTT-3'的扩增效果最好,引物与探针混合液的最适浓度为5.000μmol·L^(-1)。用LFD-RAA方法检测RHdV-2的最适反应温度为39℃,最适反应时间为30 min。敏感性检测结果显示:以RHdV-2 VP60重组质粒为模板的最低检出量为6.7×103 ng·μL^(-1)。用建立的RAA-LFD方法对RHdV^(-1)的检测结果呈阴性,对RHdV-2的检测结果呈阳性,表明该方法的特异性良好。重复性检测结果显示,同一批次和不同批次试剂盒的检测结果均一致,表明重复性好。31份临床样品检测结果显示,5份为RHdV-2阳性样品。【结论】建立的检测RHdV-2的RAA-LFD方法具有简捷、易操作的特点,适合养殖场对RHdV-2的快速诊断。

布鲁氏菌RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella)Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性检测。结果显示该检测方法在39℃反应20 min以上便可肉眼观察到明显结果。特异性试验结果显示除布鲁氏菌基因组呈阳性外,维氏气单胞菌、大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到101拷贝/μL的质粒标准品,比常规PCR高出100倍,敏感性较高;重复性试验结果显示,3次批间重复试验无明显差异,稳定性良好。利用该方法检测34份临床样品,其检测结果与普通PCR检测结果符合率为100%。本研究建立了一种快速检测布鲁氏菌的方法,该方法不需要特殊的仪器,操作简便,灵敏度高,肉眼即可观察到结果,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术的B、E型腺病毒快速可视化检测方法的研究与评价

目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测技术,评价其灵敏度与特异性,并验证最佳反应温度与反应时间,同时利用该法对19例B、E型腺病毒感染患者及10例健康志愿者鼻咽拭子标本进行检测。结果腺病毒LFD-RPA法检测灵敏度可达10拷贝/μl,与q PCR方法相近,且不会与其他亚属腺病毒及其他病毒发生交叉反应。反应可在25~45℃温度范围内高效进行,检测全程仅需15~20 min。利用临床咽拭子标本对检测体系进行评估,其灵敏度及特异性均达100%。结论该检测方法灵敏度高、特异性强、操作简单,反应快速,能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖,在基层卫生部门,尤其在野外及现场检测中具有极大的应用潜力。

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示:猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^(-1),优于常规PCR方法,且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围(30~45℃)内高效进行,20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估,其检出率高于细菌分离与常规PCR方法,具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点,同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于野外及现场检测。

金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用

靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速检测方法。该方法在引物浓度200 nmol/L、33℃反应20 min即可实现靶标基因片段的有效扩增。特异性分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌与其他常见致病菌菌株间不存在交叉反应,灵敏度分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌的检出限为4 fg/μL(DNA)与1.83×10^(2) CFU/mL(纯菌液)。用人工污染牛奶样品验证RAA-LFD方法的可靠性,结果显示在增菌6 h时,RAA-LFD方法可检测到1.83×10^(1) CFU/mL金黄色葡萄球菌。分别采用微生物生化鉴定法、PCR法与RAA-LFD方法对64份牛奶样品进行金黄色葡萄球菌检测,结果表明,RAA-LFD方法与微生物生化鉴定法总符合率为95.3%,与PCR法总符合率(98.4%)表现出较高的一致性。本研究建立的可视化检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单、检测结果直观、对仪器设备要求低等特点,为牛奶中金黄色葡萄球菌的检测提供新的发展方向。

烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。

柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征RPA-LFD诊断方法的建立及初步应用

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)给我国养猪业带来了巨大的损失.为快速、便捷诊断该病,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)的HP-PRRS诊断方法.针对HP-PRRSV Nsp2基因特异序列,设计生物素(Biotin)标记的特异性引物和FAM荧光素标记的探针,对RPA-LFD的反应体系和条件进行优化,结果显示,HP-PRRSV RPA-LFD最佳反应体系为:上下游引物(0.42 pmol/μL)各2.1μL,探针(0.3 pmol/μL)0.6μL,Rehydration buffer 29.5μL,cDNA模板1μL,ddH_(2)O 12.2μL,MgOAc 2.5μL,共50μL;最佳反应条件为:37℃,20 min.该方法同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332株(PRRSV VR2332)和NADC30-like株等10种常见感染猪的病原,结果显示,该方法除对HP-PRRSV检测呈阳性外,对PRRSV VR2332株、NADC30-like和其它9种感染猪的病原检测均为阴性,特异性强;该方法对10倍系列稀释的质粒标准品检测结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为4.05×10^(1)拷贝/μL,灵敏度高;该方法与HP-PRRSV商品化荧光检测试剂盒同时检测50份临床样品,二者符合率为100%.本研究首次建立了一种特异、灵敏、方便、快速、现场化的HP-PRRSV RPA-LFD检测方法,为HP-PRRS的快速诊断和流行病学调查提供了新的技术手段.

柑橘黄龙病RAA-LFD检测方法的建立

本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件的优化,建立了柑橘黄龙病菌RAA-LFD检测方法。该方法可快速高效地完成柑橘黄龙病菌检测,灵敏度可达到10 copies/μL;特异性试验结果显示,除柑橘黄龙病菌基因组呈阳性外,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、沙门氏菌均为阴性,特异性良好。利用该方法检测102份柑橘叶样本,结果显示,56份样本核酸为阳性,46份样本核酸为阴性;与荧光定量PCR法、RAA荧光法比较,RAA-LFD检测法弱阳的检出率偏低,但是RAA-LFD检测法摆脱了仪器依赖,操作更简便快速,无需电泳检测,避免了核酸扩增产物开盖污染的风险,适用于柑橘黄龙病菌的快速检测,适合在基层使用。

基于RPA-LFD的鸭星状病毒2型核酸快速可视化检测技术

为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;进一步验证该方法的灵敏性、特异性和准确性。结果显示,筛选获得1对引物和匹配探针适用于DAstV-2核酸的RPA-LFD检测,探针的最佳工作浓度为5μmol/L;建立的RPA-LFD检测方法对DAstV-2核酸的最低检测限为3×10^(1)copies/μL;可特异性检测DAstV-2核酸,对鸭肝炎病毒(DHV)、鹅星状病毒(GAstV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鸭瘟病毒(DPV)的检测结果均为阴性;对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织病毒核酸样本的检测结果显示,建立的RPA-LFD与实时荧光定量PCR检测结果的符合率为100%,且该检测方法更加便捷。本试验结果表明,利用RPA-LFD检测DAstV-2核酸灵敏度高、特异性强、准确性高,操作简单、检测快速,可在38℃恒温条件下15 min内实现DAstV-2核酸的快速可视化检测。

西番莲夜来香花叶病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立

根据西番莲上发生的夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了一种快速检测TeMV的方法,对该检测方法中的反应时间、温度、探针浓度、引物浓度进行了优化,并检测了该方法的特异性和灵敏度。试验结果表明,RT-RPA-LFD检测体系的最佳反应条件是温度37℃、反应时间13 min、探针浓度5μmol·L^(-1)、引物浓度10μmol·L^(-1)。该方法能够特异性检测TeMV,对含有TeMV cp质粒DNA的最低检测限度为5.125×10^(-4)ng·μL^(-1),比普通PCR检测灵敏10000倍。该方法灵敏度高、特异性强,能够用于田间西番莲样品的检测。

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL-1,略低于常规PCR(10 fg·μL-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。