耐盐转基因大豆事件AtARA6-A001外源插入片段侧翼序列及其应用

转基因大豆AtARA6-A001事件采用农杆菌介导大豆遗传转化法获得,其受体为沈农9号,具有耐盐特性,目前已经进入环境释放阶段。为明确该转基因大豆材料的分子特征及其转基因检测方法,推进该转基因事件生物安全评价工作。本研究以转基因大豆AtARA6-A001为研究对象,利用Southern杂交方法及基因组重测序技术鉴定了外源基因的拷贝数及插入位点的位置和方向。同时利用PCR扩增技术获得了外源T-DNA的左右侧翼序列,并基于左右旁侧序列,建立了转AtARA6基因耐盐大豆A001事件的特异性定性PCR检测方法。此方法能特异性检测转基因大豆植株AtARA6-A001根、茎、叶、花和种子样品,并且能够特异性识别转基因大豆事件的身份,这为后续转基因大豆及其产品的检测和监管提供技术支持。

内镜下双侧翼管神经切断术治疗难治性变应性鼻炎的效果观察

目的探究内镜下双侧翼管神经切断术治疗难治性变应性鼻炎的效果观察。方法选择2020年1月至2023年6月阶段,在本院接受难治性变应性鼻炎治疗患者64例展开回顾性分析,按收集时间及治疗方案不同分为对照组(n=33,鼻中隔矫正联合下鼻甲部分切除术),观察组(n=31,内镜下双侧翼管神经切断术),比较两组治疗前后效果差异。结果治疗3个月后,观察组鼻部症状、眼部症状对比对照组分值更低(P<0.05);治疗3个月后,观察组白介素-6(IL-6)、白介素-4(IL-4)、免疫球蛋白E(IgE)指标对比对照组表达更低(P<0.05);治疗3个月后,观察组鼻气道阻力对比对照组水平更低,鼻腔通气面积、纤毛运动速率较对照组水平更高(P<0.05)。结论内镜下双侧翼管神经切断术治疗难治性变应性鼻炎可调节炎症反应,改善临床症状及鼻腔功能值得推广。

D18S51基因座等位基因侧翼序列四碱基缺失3例

3例无关人员口腔拭子经DNA提取后采用AGCU EX20、AGCU EX30、VeriFiler Plus和PowerPlex?21四种试剂盒检测,同一样本在D18S51基因座获得了相差1个重复单元的两种等位基因分型。本文利用Sanger测序法分别对上述3例人员样本的D18S51基因座及上下游区域进行检测。经序列比对,发现3个样本的基因组中D18S51基因座下游chr18:63281892-63281895位置均存在[GTTT]的四碱基缺失。建议针对D18S51基因座设计引物时,应选择在上述碱基缺失位置上游区域进行。

晟图机械ST030高速侧翼皮壳机全球首发

2023年4月11日,第五届广印展开展首日,广东晟图智能装备有限公司(以下简称“晟图机械”)在其展位上举行了ST030高速侧翼皮壳机的全球首发仪式,现场人潮涌动,共同见证了这一重要时刻。晟图机械一直致力于精品包装设备的研发和生产,其最新研发的高速侧翼皮壳机广泛应用于奢侈品、化妆品及社会包装等产品的生产中,稳定速度可以达到1800张/h,最大制作尺寸为800mm×180mm,最小制作尺寸为200mm×50mm,是目前市场上可做侧翼尺寸最大和速度最快的设备。

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析

【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。

cisAB亚型第6、7外显子及侧翼内含子序列分析

目的 研究汉族ABO血型系统cisAB亚型的分子遗传基础。方法 在标准血清学鉴定和PCR SSP基因分型的基础上 ,对汉族cisAB亚型进行第 6、7外显子及侧翼内含子DNA扩增 ,PCR产物经割胶纯化后直接序列分析。结果 血清学鉴定表明2例标本分别为A2 B3 和A3 B ,先证者的PCR SSP基因分型肯定了其中的B和O1基因。DNA序列分析表明 ,其第 6外显子有2 6 1G缺失 /不缺失杂合 ;第 7外显子与A1基因相比 ,有T4 6 7C杂合和C80 3G杂合 ,796位为正常C ,表明其血型为罕见的cisAB亚型。结论 4 6 7T、796C和 80 3C三处核苷酸的独特性决定了cisAB亚型的分子遗传基础。

蓖麻蚕线粒体基因组中nd1及其侧翼tRNA基因的克隆与结构分析

按KoichiroTamura等 (1988)的方法制备出蓖麻蚕线粒体DNA ,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶解后 ,以pSK(+)(Ampr)为载体进行克隆 ,获得 1个 3 3kb的克隆片段。测序结果表明 ,所测序列包括部分 16SrRNA、完整的tRNA Leu ,nd1和tRNA Ser基因。其中 16SrRNA(3’端部分 )、nd1基因与家蚕具有很高的同源性。同时以nd1基因为依据构建了 17种动物的分子进化树 ,显示出蓖麻蚕与家蚕、野蚕有最近的演化关系。根据tRNA Leu和tRNA Ser基因的一级结构 ,推定了可能的二级结构 ,并与家蚕进行了比较。

奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析

牛乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是保护乳腺组织的防御因子之一,是具有多种功能的糖蛋白。关于牛LF基因的多态性研究的报道较多,但其多态性与奶牛乳腺炎相关性的研究较少。文章采用PCR-RFLP、CRS-PCR对268头中国荷斯坦牛LF基因启动子区的-926(G/A)、-915(T/G)、-478(/G)、+72(T/C)突变进行基因型分型,应用最小二乘线性模型分析LF基因多态性与体细胞评分(Somaticcellscore,SCS)的相关性。结果表明,新发现+72(T/C)和-478(/G)对SCS有显著影响,而其他两个位点对SCS影响不显著(P>0.05)。+72(T/C)的AB基因型是优良基因型,其个体的SCS值均显著低于AA型(P<0.01)、BB型个体(P<0.05)。-478(/G)位点的C等位基因是优良的等位基因,CC基因型个体的SCS值极显著低于CD、DD基因型个体(P<0.01)。因此,LF基因+72(T/C)的AB基因型和-478(/G)位点的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型,可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。

鸡8个功能基因5′-侧翼区与内含子的SNP多样性比较

本研究旨在探讨鸡功能基因5′-侧翼区的单核苷酸多态性(SNP)水平。作者以白来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料,扩增了GH、DDBC1、RIKEN、RASGRP3、IGF1、THRSP、VIP及PRL共8个基因的5′-侧翼区DNA序列。扩增序列全长为8,399bp,SNP的总数为161个,平均每52bp出现一个SNP。8个功能基因5′-侧翼区核苷酸多样性的θ均值和π均值分别为0.00620±0.00110和0.00559±0.00100。比较检验表明,5′-侧翼区的SNP多样性显著低于内含子区域。5′-侧翼区是基因表达的一个重要调控区域,在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压,其较低的SNP多样性是适应性较好的表现。Tajima检验与Fu和Li检验表明,与鸡繁殖性状显著关联的VIP基因和PRL基因很可能是人工选择或自然选择的目的基因。

水稻Ac×Ds后代基因组DNA中Ds侧翼序列的扩增及其Ds插入分析

采用TAIL-PCR技术从经鉴定含Ac/Ds双元件的材料中扩增Ds侧翼序列并测序,对水稻Ac×Ds后代基因组DNA进行Ac和Ds插入的PCR分析。利用NCBI的BLAST软件,以Ds侧翼序列为待查询序列进行GenBank在线搜索比对,获得Ds插入相关基因的染色体定位和功能注释等信息。对扩增的93个有效Ds侧翼序列进行分析,结果显示,有21个水稻杂交后代中Ds插入于基因编码区,其余72个插入在基因间序列,其中12个插入在特定基因的上游3kb以内的间隔区。本研究强调了提高Ds侧翼序列扩增和Ac/Ds植株筛选效率的技术关键。

野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X anthom onas camp estris pv.camp estris,简称X cc),是一类能在全球范围引起十字花科植物黑腐病的γ-变形菌纲细菌。该菌有一个长41.7 kb的H rp致病岛,包含41个开放阅读框(ORF)。H rp致病岛5′端边界为IS1479插入元件,3′端边界为IS1595插入元件。G+C含量为62.3%,明显低于全基因组64.9%的G+C含量。根据基因类型,将该致病岛分为三个区段:位于致病岛中心区的hrp基因簇、及其左侧翼的假定基因区段(HGR)和右侧翼的降解酶类基因区段(EGR)。HGR长7.4 kb,注释蛋白编码基因6个,全部为功能未知的假定基因。EGR长9.3 kb,注释蛋白编码基因8个,其中6个为降解酶类基因。为了鉴定hrp基因簇侧翼序列的功能,采用标记置换的突变方法,将X cc 8004的hrp基因簇右侧翼EGR片段缺失。该突变体8004ΔR对寄主植物的致病力比野生型菌株显著降低,而在非寄主植物辣椒ECW-10R上仍能引起过敏反应。该突变体其它的致病相关生化因子,如胞外多糖产量和胞外酶的活力均未受明显影响。实验结果表明EGR区段的缺失不影响三型分泌系统的正常功能,也不影响该菌在基本培养基上的生长,但使X cc的致病力明显降低,提示X cc 8004菌株hrp基因簇右侧翼序列中存在与致病相关的基因。

剑尾鱼线粒体DNA D-环及侧翼tRNA^(thr)和tRNA^(pro)序列与结构分析

采用PCR方法从剑尾鱼(Xiphophorushelleri)线粒体基因组中扩增到1段约15.5kb的片段,测定了其中627个碱基的序列。经测序分析表明,该扩增片段包括486bp的D 环的部分序列以及D 环5'端的tRNAthr和tRNApro基因的完整序列。其中486bpD环序列包含3段保守的终止相关序列TAS、与TAS互补的序列以及类似其他鱼类线粒体CSB序列。tRNAthr由线粒体DNA的H链编码,长度为72bp。tRNApro由线粒体DNA的L链编码,长度为69bp。并绘制了这2种tRNA的二级结构图。本研究所测定的基因序列已登录国际GenBank数据库,序号为AF489918。

高效、新T-DNA侧翼序列分离技术--Actail-PCR

【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷(poly(dI))连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,随后利用5'端的通用引物与T-DNA载体上的巢式引物依次组合,在65℃(10个循环后逐步降温至58℃)的高严谨条件下逐步扩增特异片段,同时抑制非特异性扩增,可以显著提高目标片段的扩增效率,减少假阳性。【结论】相对传统的TAIL-PCR,Actail-PCR技术可以更高效地分离T-DNA插入突变体的侧翼基因组序列。

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L^(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g^(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。

一种DNA侧翼序列分离技术——TAIL-PCR

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错PCR(简称TAIL PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL PCR技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔者综述了TAIL PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的 研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株 pgm位点及其侧翼序列的变异 ,了解不同疫源地菌株间的毒力差异 ,为鼠疫防治提供帮助。方法 比较分析现有 4株菌的 pgm位点及其侧翼序列的变异 ,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增 2 6 0株中国自然分离株和 7株假结核耶尔森菌。结果 除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外 ,其他菌株均缺失了YP16 6 6的 70～ 87bp之间的 18bp碱基。 14 0 6bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株的 pgm位点下游都没有IS10 0插入 ;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有 1个IS2 85插入 ,在其下游 3kb区域还有 1个IS10 0插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的 pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的 pgm位点缺失 ,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型 ,松辽平原B型 ,昆仑山A、B型 4种生态型菌株中。结论 北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支 ,建议归为第 4个生物型———田鼠型。北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株的 pgm位点 ,由于在其下游没有IS10 0插入 ,所以稳定、不易缺失?

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

大豆二核苷酸SSR侧翼序列保守性分析

从NCBI下载了大豆的EST和GSS序列,以SSR两侧序列各100 nt的片段作为分析材料,统计SSR数目、计算侧翼序列碱基组成,对SSR侧翼序列进行了序列比对和数据库blast搜索。结果表明:大豆SSR分布频率为1/6.67kb,侧翼序列GC含量为37.83%,二核苷重复是SSR的主要类型(65.7%),同一种重复基元的SSR存在多类型侧翼序列,同一类型的侧翼序列高度保守,不同类型的侧翼序列之间相似性较小,尤其是非SSR区域可以存在与SSR侧翼序列相同的序列。由上述结果推断SSR引物可能扩增出不含SSR的产物,易位可以产生形成新类型SSR。这一分析结果有助于提高SSR引物设计效率和进一步阐明SSR的形成机理。