成年大鼠侧脑室下区星形胶质细胞的分离培养及纯化研究

成年哺乳动物侧脑室下区星形胶质细胞(AST)的神经干细胞特性研究是当前神经科学领域的热点,为了进一步了解AST生物学特性,体外培养是探讨AST细胞学特性的有力手段,而怎样通过体外培养得到高纯度的成年AST是亟待解决的问题。本研究以2.5月的成年大鼠侧脑室下区为实验材料进行AST培养,并对传统的培养方法进行改良。首先在AST培养基中增加B27添加剂,结合成年AST体外生长特性,采用低浓度血清(2.5%～5%)和血清浓度调整法对培养的AST进行纯化。然后采用GFAP免疫细胞化学染色方法对培养至14d的细胞进行鉴定及纯度检测,采用流式细胞仪检测B27添加剂对AST细胞周期的影响。结果显示:B27添加剂能有效促进体外培养的成年AST的生长和增殖,采用此方法培养的成年AST纯度达90%以上;B27添加剂与低浓度血清的组合以及根据细胞特性及时调整血清浓度是一种有效的纯化成年AST方法。本方法的建立可望为AST的神经干细胞特性研究提供理想的细胞模型。

成人侧脑室下区Nestin阳性细胞的免疫组化观察

目的 探讨成人侧脑室下区 (SVZ)Nestin阳性细胞的分布及其化学特点。方法 采用 3 3 1B、10C2、Rat4 0 1、GFAP、NSE和viminten等神经细胞标志物对成人SVZ区进行免疫组织化学研究。结果 SVZ区存在较多Nestin反应阳性细胞 ,GFAP免疫阳性细胞及较少的NSE免疫阳性细胞。Nestin免疫反应阳性细胞可分为两类 ,一类为卵圆形 ,胞体较大 ,少有纤维突起 ;一类为星形 ,胞体较小 ,发出多支放射状的纤维突起。Nestin免疫阳性细胞均不与GFAP及NSE发生交叉反应。成人SVZ区细胞未见有viminten的表达。结论 成人SVZ区可能存在神经前体细胞和星形胶质样Nestin免疫阳性细胞。

电针对脾虚型幼鼠侧脑室下区碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响

目的:探讨电针对脾虚证大鼠侧脑室下区碱性成纤维细胞生长因子表达的影响。方法:健康SD雄性大鼠96只,体重(50±5)g,鼠龄为4周龄,随机选取32只作为正常组,其余64只造模。造模成功后随机分为模型组、电针组,每组各32只。3组再分别随机分为7天组、14天组、28天组和49天组4个亚组,每亚组8只。用利血平腹腔注射联合大黄灌胃造SD雄性幼鼠脾虚证模型,造模期14天。造模结束后,电针组大鼠针刺双侧足三里和三阴交穴,以疏密波刺激20min,每天1次,治疗7、14、28、49天后处死,采用免疫组织化学法观察侧脑室下区碱性成纤维细胞生长因子数量表达的变化。结果:电针治疗7天,针刺组碱性成纤维细胞生长因子数量明显较模型组和正常组升高(P<0.01);电针治疗14天,其数量有所回落,与同期模型组相当,但仍比正常组高(P<0.05),这一变化可持续至28天;电针治疗49天,针刺组碱性成纤维细胞生长因子数量仍较同期模型组和正常组高(P<0.01)。结论:早期介入电针治疗可以更早地能对脾虚证所造成对脑功能损害起到保护作用。同时,持续的电针治疗可以在相当长的一段时期内保持碱性成纤维细胞生长因子数量有较高的表达。

转录因子Sp8在成年大鼠侧脑室下区新生神经元中的表达

目的观察转录因子Sp8在成年大鼠侧脑室下区新生神经元中的表达。方法 4只成年大鼠经心脏灌注固定,利用免疫荧光标记法并结合激光共焦显微镜扫描技术,观察Sp8在大鼠侧脑室下区新生神经元中的表达。结果成年大鼠整个侧脑室下区,从吻侧到尾侧都存在大量的新生神经元,这些新生神经元分布多呈链状;与尾侧相比,吻侧侧脑室下区有更多的新生神经元产生。整个侧脑室下区的背外侧区域产生的新生神经元数量最多且分布最密集;而且这些新生神经元中的绝大多数都表达转录因子Sp8。结论 Sp8在侧脑室下区具有广泛的表达,可能与新生神经元的产生及相关的调控过程关系密切。

模拟失重对成体侧脑室下区OX42阳性细胞表达的影响

为了观察大鼠模拟失重后侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)OX42阳性细胞的表达变化,本研究采用雄性SD大鼠尾部悬吊法建立模拟失重模型,按体重配对原则随机将20只大鼠分为4组:即模拟失重2周组(TS2W),模拟失重4周组(TS4W)和相应的正常对照(CON2W和CON4W)2组。用特异性标记小胶质细胞的OX42抗体行免疫组织化学ABC法染色,观察大鼠模拟失重后OX42阳性细胞在SVZ的形态和数量变化。结果显示:TS2W和TS4W组侧脑室下区OX42阳性小胶质细胞数显著增多,并呈显著活化状态,表现为阿米巴样小胶质细胞。本研究结果提示小胶质细胞可能参与失重的病理生理过程。

新生小鼠脑提取液对成年小鼠侧脑室下区干细胞增殖的作用

目的研究新生小鼠小脑提取液(ECNM)对成年鼠侧脑室下区神经干细胞的影响。方法采用脑立体定位技术注射新生鼠小脑提取液至成年鼠侧脑室,通过Nestin和Musashi免疫组化染色,显示提取液对神经干细胞的影响。结果高剂量组(25mg/ml)室下区的神经干细胞明显增多(P<0.01),低剂量组(2.5mg/ml)也有增加(P<0.01),溶媒对照组无明显阳性染色。结论新生鼠小脑提取液能够促进成年鼠侧脑室下区神经干细胞分裂、增殖。

小鼠侧脑室下区基因表达的增龄性变化研究

目的研究幼年期、成年期和老年期小鼠侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)中基因表达的增龄性变化。方法分别提取3周龄、6月龄和20月龄C57小鼠SVZ的mRNA,基于转录组测序及实时荧光定量PCR技术,检测SVZ中在不同年龄阶段的基因表达差异。结果以幼年期小鼠为对照,成年期检测到253个差异表达的基因,老年期检测到519个,以成年期作对照,老年期检测到147个差异表达的基因。GO分析发现成年期小鼠与幼年期相比差异表达基因主要涉及营养和代谢,老年期小鼠与成年期相比主要涉及中枢神经系统神经元分化等。KEGG分析发现差异表达基因主要涉及通路为蛋白质消化吸收、神经活性配体-受体相互作用等。结论该研究提供了不同年龄段SVZ转录水平基因变化的数据,为探讨SVZ的功能发育和退化,进一步治疗和抵抗神经衰老提供新的理论依据和方法。

大鼠侧脑室下区神经干细胞具有不易兴奋性

目的建立体外培养大鼠侧脑室下区神经干细胞的方法,观察大鼠侧脑室下区神经干细胞的膜兴奋性。方法无血清培养方法体外分离、纯化孕15～16 d wistar胎鼠的侧脑室下区神经干细胞,用免疫荧光鉴定干细胞标记蛋白nestin表达情况、用tuj-1和GFAP免疫染色研究体外NSC的分化情况;取第二代神经干细胞给予DiBAC4(3)染色后,经高浓度氯化钾刺激,激光共聚焦显微镜动态扫描,观察侧脑室神经干细胞的兴奋性。结果采用无血清培养基体外分离的神经干细胞具有自我增殖、多向分化潜能等干细胞一般特点,且表达干细胞的标记蛋白nestin;采用DiBAC4(3)染色,高浓度钾刺激后,细胞荧光强度无显著变化,即细胞膜电位无明显改变,神经干细胞具有不易兴奋性。结论采用无血清培养方法成功分离扩增大鼠脑内神经干细胞;由大鼠侧脑室分离而来的神经干细胞具有不易兴奋性。

川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区细胞增殖的作用

目的观察川芎嗪对大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室下区(SVZ)细胞增殖的作用。方法SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血模型组和川芎嗪组。线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型,川芎嗪组术后2h腹腔注射川芎嗪(80mg/kg,1次/d),各组术后4h腹腔注射5-溴脱氧尿核苷(BrdU,50mg/kg,1次/d)。术后7、14、21d取材,采用免疫组织化学染色观察SVZBrdU阳性细胞数和Doublecortin(DCX)的表达。结果缺血模型组术后7d时SVZBrdU阳性细胞较假手术组明显增加(P<0.01),并持续至14d,21d减少;川芎嗪组14dSVZBrdU阳性细胞达峰值,21d有所减少,与缺血模型组比较,7、14dBrdU阳性细胞均明显增加(P<0.01)。缺血模型组7d时SVZ有DCX阳性表达,14d达最多,21d表达减少,与假手术组相应时间点比较均明显增加(P<0.01);川芎嗪组随缺血时间延长SVZDCX表达明显增强,21d仍处于高水平,与缺血模型组比较,14、21dDCX表达明显增强(P<0.01)。结论川芎嗪对成年大鼠局灶性脑缺血诱导的SVZ神经干细胞/祖细胞增殖可能有促进作用。

丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖与c-myc、c-jun表达的影响

目的探讨丹龙醒脑方对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)增殖与c-myc、c-jun表达的关系。方法采用线栓法制备大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。150只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹龙醒脑方小、中、大剂量组。于再灌注24 h后,丹龙醒脑方各剂量组予相应剂量药液灌胃,模型组和假手术组予等体积蒸馏水灌胃。1次/d,连续7 d。再灌注1、3、7 d采用m-NSS法进行神经功能缺损评分,再灌注7 d取缺血侧SVZ脑组织,采用Brdu免疫组化检测NSCs增殖,RT-q PCR、Western blot分别检测c-jun、c-myc m RNA和蛋白的表达。结果与假手术组比较,其余各组神经功能缺损评分明显升高(P<0.01);再灌注3、7 d,与模型组比较,丹龙醒脑方各剂量组神经功能缺损评分明显降低(P<0.01)。与假手术组比较,其余各组Brdu阳性细胞率明显升高;与模型组比较,丹龙醒脑方各剂量组Brdu阳性细胞率亦明显升高(P<0.01)。丹龙醒脑方各剂量组较假手术组、模型组c-jun、c-myc蛋白及m RNA表达均明显增强(P<0.05,P<0.01)。结论丹龙醒脑方能改善脑缺血后神经功能,促进SVZ NSCs增殖,其机制可能与增强c-jun和c-myc表达及延长表达持续时间有关。

电针对脑缺血大鼠侧脑室室管膜下区巢蛋白表达的影响

目的观察电针对脑缺血大鼠侧脑室室管膜下区巢蛋白(Nestin)表达的影响,探讨不同针刺处方防治脑缺血作用机制。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、电针1组、电针2组。电针1组电针双侧“丰隆”(ST40)(2/100 Hz,1~3 mA),每天1次,每次30分钟,连续治疗7天;第8天,电针1、2组和模型组用50%FeCl 3滤纸贴敷大脑中动脉20分钟造成脑血栓模型,术后电针1、2组电针ST40、“百会”(GV20),每天1次,连续7天。术后1天利用神经功能缺损评分法(neurological deficit score,NDS)进行行为学检测,苏木素伊红染色观察缺血半暗带组织形态,免疫组化法检测缺血侧侧脑室室管膜下区Nestin的表达。结果模型组大鼠NDS升高(P<0.05),缺血半暗带神经细胞水肿明显,神经元核固缩,术后侧脑室室管膜下区Nestin面密度升高,持续至术后7天(P<0.01)。电针治疗后神经功能缺损评分降低(P<0.05),缺血半暗带神经细胞水肿减轻,细胞形态趋于正常,电针1、2组侧脑室背外侧角Nestin表达均增高,从术后1天(电针1组P<0.01,电针2组P<0.05)持续至术后7天(P<0.01),电针组侧脑室外侧壁Nestin表达在术后1天升高(P<0.01),术后7天升高差异没有统计学意义(P>0.05)。电针1、2组之间差异无统计学意义(P>0.05),但趋势上电针1组高于电针2组。结论电针可改善脑缺血后神经功能,减轻缺血性脑损伤,促进侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖,促进脑损伤后神经修复,在脑缺血前进行电针治疗效果更佳。

侧脑室室管膜下区神经再生的研究进展

神经再生(Neurogenesis)是指具有自我更新能力的神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)经过迁移、增殖,最终分化为具有特定功能的神经细胞的过程。以往人们认为,神经再生只存在于胚胎期或外周神经系统,近几年发现,在成年动物的中枢神经系统也存在神经再生,研究发现侧脑室室管膜下区(SVZ)是神经再生发生的主要区域之一,产生新的神经元和神经胶质细胞通过RMS通路运输至嗅球进而对嗅觉损伤部分进行修复。本文主要从成年神经再生的发展、神经再生与疾病的关系、神经再生的过程等方面进行综述。

电针对高血脂合并脑缺血大鼠侧脑室室管膜下区星形胶质细胞活化的影响

目的观察电针对高血脂合并脑缺血大鼠前脑侧脑室室管膜下区星形胶质细胞活化的影响。方法采用SD成年雄性大鼠49只,随机分为正常组,模型组、假手术组、电针1组和电针2组。除正常组,其余各组大鼠高脂饲料喂养42 d,电针1组电针丰隆,每天1次,治疗7 d。第50天,模型组和电针组大鼠采用50% FeCl_3诱导建立高血脂合并脑血栓模型,术后电针组电针丰隆和百会,每天1次,持续14 d。用神经功能评分方法评定行为学变化,用生物化学法检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平,采用HE染色观察形态学改变,免疫组化方法检测损伤侧前脑侧脑室室管膜下区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果模型组大鼠高血脂合并脑缺血术后TC、TG、LDL升高,HDL降低,差异具有统计学意义(P <0. 05),电针组TC、LDL水平降低(P <0. 05)。模型组大鼠神经功能评分增高,HE染色可见皱缩神经元,整体组织形态结构显脑缺血症,侧脑室室管膜下区GFAP面密度明显升高(P <0. 01),电针治疗可改善神经功能评分,缺血侧细胞核逐渐恢复正常,治疗后面密度持续增加至术后14 d,术后7 d显著,电针1组高于电针2组(P <0. 05)。结论高血脂阶段电针丰隆,脑缺血后电针丰隆、百会可通过调节血脂代谢,促进星形胶质细胞活化以及受损神经系统修复。

经颅磁刺激帕金森病模型小鼠体内神经干细胞的增殖

背景:神经毒素1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶能够诱导类似于在原发性帕金森病所观察到的临床、生化和病理的特征。目的:观察重复经颅磁刺激对帕金森病模型小鼠侧脑室室管膜下区内源性神经干细胞增殖的影响及对情绪障碍的影响。方法:选用雄性C57BL/6J小鼠72只,随机分为4组。帕金森病模型组和磁刺激组采用背部皮下注射1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶注射4次制备急性帕金森病模型,末次注射24 h后,对磁刺激组小鼠进行重复经颅磁刺激干预,刺激频率为1 Hz,刺激强度为阈上20%,刺激5个序列,每个序列刺激25次,分别治疗1,3,7 d;假磁刺激组不暴露于磁场下;帕金森病模型组不给予任何处理;盐水对照组皮下注射与帕金森病模型组等量的生理盐水。对重复经颅磁刺激干预前后进行高架十字迷宫实验,以评价其情绪障碍。利用免疫组织化学染色的方法检测室管膜下区巢蛋白阳性细胞数。结果与结论:①高架十字迷宫试验:各组内及各组间在不同时间点,小鼠的开放臂停留时间比例(OT%)差异无显著性意义,但重复经颅磁刺激干预后的小鼠OT%有较明显的下降。②巢蛋白免疫组织化学染色结果:帕金森病模型组较盐水对照组巢蛋白的阳性细胞数于第3天和第7天时明显增高,较假磁刺激组无统计学意义。②磁刺激组较假磁刺激组及帕金森病模型组巢蛋白的阳性细胞数明显增高。③巢蛋白的阳性细胞数随时间的延长而增加,内源性神经干细胞沿一定的路径逐渐往外迁移,第3天时有一部分迁移到胼胝体,到第7天时有一部分能迁移到大脑皮质。说明重复经颅磁刺激能促进内源性神经干细胞增殖,内源性神经干细胞增殖具有时间依赖性。

Ligase Ⅳ基因突变对小鼠生长及成体神经系统发育的影响

目的研究Ligase Ⅳ对小鼠生长及成体神经系统发育的影响。方法记录野生型(WT)和突变型Ligase Ⅳ^(Y288C)纯合子(MU)小鼠的生存情况,绘制小鼠生存曲线;记录小鼠不同生长时期的体质量和脑质量,监测小鼠个体发育和脑发育差异;用Sox2和Nestin免疫染色来检测小鼠侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的数量;用Ki67和Nestin免疫染色来检测小鼠SVZ的NSCs增殖情况;原代分离培养小鼠SVZ的NSCs,用克隆形成实验检测细胞的生长状况。结果 MU小鼠的平均寿命明显低于WT小鼠(P<0. 000 1);MU小鼠的体质量和脑质量在生长的各个时期均明显小于WT小鼠(P<0. 000 1); MU小鼠大脑SVZ的NSCs数量及增殖细胞数均比WT少(P<0. 011 3); MU小鼠NSCs的克隆形成能力低于WT小鼠(P<0. 001)。结论 Ligase Ⅳ突变在小鼠生长及成体神经系统发育的过程中起重要作用。

FMRP促进胚胎小鼠大脑皮层神经元发育与迁移

目的观察脆性X智力障碍蛋白(FMRP)对胚胎小鼠大脑皮层神经元发育与迁移的影响。方法应用基因定点突变技术构建pEGFP-FMRPmutant与pEGFP质粒;采用子宫内胚胎鼠电极针刺技术将质粒转染到胚胎鼠侧脑室并用PCR和Southern analysis技术鉴定FXS小鼠类型;尼氏染色与荧光免疫组织化学双染技术分析大脑皮质各细胞层神经元分布数目并进行统计学分析。结果尼氏染色确定胚胎小鼠大脑皮质各细胞层,荧光免疫双染共聚焦显示实验组胚胎小鼠侧脑室区/侧脑室下区(VZ/SVZ)(1.76倍,P=0.035)和中间带(IZ)(1.71倍,P=0.002)表达标记EGFP(绿色)的神经元数目比对照组显著增多;实验组小鼠VZ/SVZ(5.48倍,P=0.006)和IZ(2.16倍,P=0.043)同时表达标记EGFP(绿色)和Nestin(红色)神经元数目亦比对照组显著增多。结论 FMRP促进胚胎小鼠大脑皮层神经元前体细胞的分化发育与迁移,FMRP缺乏时神经元发育及迁移滞后。

A2AR基因敲除对小鼠脑缺血再灌注后SVZ区星形胶质细胞激活的影响

通过研究腺苷A2A受体(A2A receptor,A2AR)基因敲除对小鼠局灶性脑缺血再灌注后侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)星形胶质细胞(astrocyte,Ast)数目及形态的影响,为腺苷类药物在脑卒中类疾病中的应用提供实验依据。采用大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlu-sion,MCAO)复制局灶性脑缺血再灌注模型,动物分为假手术组(S)和模型组(M),其中M组根据基因类型分为A2AR基因敲除模型组(MKO)和A2AR基因野生模型组(MWT),MKO组和MWT组根据再灌注时间都分为1 d组、3 d组和7 d组,S组分为A2AR基因敲除假手术组(SKO)和A2AR基因野生假手术组(SWT),共8组;对实验小鼠进行神经行为学评分,脑组织用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死灶,苏木素伊红(HE)染色和尼氏(Nissl)染色观察脑组织大体形态,以及应用免疫荧光法观察SVZ区Ast的特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein,GFAP)表达。结果显示,所有M组小鼠在脑缺血再灌注后均出现神经功能缺损症状,神经行为学评分显示MKO 3 d组低于MKO 1 d组(P<0.05);TTC显示M组小鼠脑组织均有白色梗死灶;免疫荧光结果显示S组小鼠SVZ区域仅有少量Ast表达,M组表达明显增多,MKO 7 d组Ast表达量低于MWT 7 d组(P<0.05);Ast表达与神经行为学评分呈显著负相关(r=–0.621,P<0.01)。结果证明,A2AR基因敲除对小鼠局灶性脑缺血再灌注后,在急性期能够减轻肢体活动障碍,在恢复期能够调控Ast的激活,减少胶质瘢痕形成,是其促进后期神经再生的可能因素之一。

头针影响脑出血后神经干细胞增殖机制研究

目的:观察"百会"透"曲鬓"针刺法对脑出血大鼠侧脑室下区(SVZ)神经干细胞增殖的影响及Shh通路在此过程的作用。方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、激动剂组,每组18只。采用自体血注入右侧大脑尾状核制备脑出血大鼠模型。针刺组予"百会"透"曲鬓"针刺法,激动剂组予腹腔注射Shh通路激动剂purmorphamine(1 mg/kg),两组均每天干预1次,连续7 d。观察各组治疗前后Bederson评分,HE染色法观察出血区脑组织病理损伤情况,免疫荧光法观察SVZ BrdU^+/Nestin^+细胞数,免疫组织化学法检测基底节部Shh通路相关因子Shh、Gli1的表达。结果:与同组治疗前比较,治疗后模型组、针刺组、激动剂组Bederson评分显著降低(P<0.05,P<0.001);与空白组比较,治疗前模型组、针刺组、激动剂组Bederson评分显著升高(P<0.001),治疗后模型组Bederson评分显著升高(P<0.001);与模型组比较,治疗后针刺组、激动剂组Bederson评分显著降低(P<0.05)。模型组脑出血组织周围红细胞浸润,有水肿带形成;针刺组和激动剂组可见陈旧性出血灶形成,组织结构排列紊乱。与空白组比较,模型组大鼠基底节部Shh、Gli1阳性表达显著升高(P<0.001);与模型组比较,针刺组和激动剂组SVZ BrdU^+/Nestin^+细胞数明显增多(P<0.001),基底节部Shh、Gli1阳性表达显著升高(P<0.001)。结论:"百会"透"曲鬓"针刺法可明显改善脑出血大鼠神经功能,这可能与其激活Shh通路,继而促进SVZ神经干细胞增殖有关。