梨果黑斑病菌磷酸二酯酶PDE基因克隆及其在侵染结构分化中的表达分析

磷酸二酯酶(PDE)能够特异地催化cAMP/cGMP 3′, 5′环磷酸的3′环磷酸键水解,调节胞内cAMP水平,进而调控致病真菌的生长发育,但PDE基因在梨果黑斑病菌中的具体调控机制有待研究。本研究采用反转录PCR(RT-PCR)克隆了梨果黑斑病菌Alternaria alternata中的PDEL和PDEH基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等在线分析工具对AaPDEL和AaPDEH基因及其编码蛋白进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了PDEL和PDEH基因在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达特性。克隆得到梨果黑斑病菌PDEL和PDEH,分别命名为AaPDEL和AaPDEH,蛋白编码区(CDS)长度分别为3 132和2 886 bp,分别编码1 043和961个氨基酸。生物信息学分析表明AaPDEL和AaPDEH均属于不稳定亲水蛋白,不含信号肽也无跨膜结构,均具有多个磷酸化位点,分别定位于线粒体和细胞核上;AaPDEL和AaPDEH分别具有ClassⅡ型和Ⅰ型保守催化结构域。系统分析结果表明,AaPDEL和AaPDEH与小麦褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis)和番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)亲缘关系最近,同源性分别高达79.25%和88.80%。qRT-PCR结果显示,疏水性诱导,A.alternata侵染结构分化过程中,AaPDEL和AaPDEH基因在附着胞形成阶段(6 h)表达量显著提高,较萌发初期阶段(2 h)分别上调1.19和1.97倍,表明AaPDEL和AaPDEH在A.alternata侵染结构分化中具有重要的调控作用。本研究为进一步从分子水平揭示PDE调控机制奠定了基础。

梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata)hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控

【背景】羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase,HNR)是1,8-间苯二酚(1,8-dihydroxynaphthalene,DHN)黑色素合成途径中起关键作用的酶,研究表明HNR不仅参与真菌黑色素合成,而且对其生长发育及致病性也具有一定的调控作用,但HNR对真菌病原物侵染结构分化的调控研究鲜见报道。【目的】在对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata)HNR的基因进行克隆与生物信息学分析的基础上,通过药理学方法初步探讨HNR对A.alternata生长及侵染结构分化的调控作用,为进一步揭示HNR在A.alternata侵染结构分化形成过程中的分子机制提供理论依据。【方法】对梨果黑斑病菌A.alternata的2个hnr基因进行了克隆;通过gene structure display server、open reading frame(ORF)Finder及conserved domain search等数据库及相关软件,对hnr基因及蛋白进行生物信息学分析,并利用HNR特异性抑制剂三环唑处理分析其对A.alternata生长发育、黑色素合成和侵染结构形成的影响,同时采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析了hnr基因在A.alternata不同侵染结构分化时期的表达特性。【结果】从梨果黑斑病菌A.alternata克隆得到2个羟基萘还原酶基因hnr的编码区全长,分别命名为Aa4hnr和Aa3hnr,其中Aa4hnr基因全长为1266 bp,编码了268个氨基酸,无内含子,有9个ORF;Aa3hnr基因全长为1356 bp,编码了267个氨基酸,含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子,有17个ORF;进化分析表明,Aa4hnr和Aa3hnr与Ophiobolus disseminans和Alternaria arborescens分别具有较高的一致性,同时Aa4hnr和Aa3hnr编码的蛋白均含有NAD(P)结合域,属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)家族。药理学结果表明,三环唑处理显著降低了A.alternata DHN黑色素的生物合成,抑制了疏水性诱导的A.alternata侵染结构的形成;进一步分析Aa4hnr和Aa3hnr在疏水表面诱导的A.alternata孢子萌发阶段(2 h)、附着胞形成阶段(6 h)、侵染菌丝形成阶段(8 h)的基因表达量,Aa4hnr的基因表达量在A.alternata侵染结构分化的各个时期均发生下调,Aa3hnr在附着胞形成阶段(6h)表达量下调,然而在侵染菌丝形成阶段(8h)显著上调表达。【结论】Aa4hnr和Aa3hnr对梨果黑斑病菌侵染具有一定的调控作用。

梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析

【背景】钙/钙调素依赖型蛋白激酶(Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase,CaMK)是真核生物细胞钙信号途径中钙调素下游的一类重要靶蛋白,对病原物生长、胁迫响应及致病性等具有重要的调控作用。【目的】对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata)AaCaMK基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在侵染结构分化过程中的基因表达情况进行分析,为进一步研究梨果黑斑病菌钙离子信号途径中AaCaMK对A.alternata侵染结构分化调控的分子机制提供一定的理论依据。【方法】采用同源克隆法从A.alternata JT-03中克隆得到3个AaCaMK基因;通过TMHMM、Prot Scale、SOPMA等软件对AaCaMK基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术分析AaCaMK在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达情况。【结果】克隆得到片段分别为1212、1200、2349 bp的AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3基因;生物信息学分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3均含有典型的蛋白激酶超家族催化结构域(PKC_(L)ike Superfamily),并且AaCaMK1和AaCaMK2共同含有Ca MK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(STKc_(C)a MK),AaCaMK3含有LKB1/Ca MKK类丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(STKc_(L)KB1_(C)a MKK);同源性分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3分别与玉米大斑病菌CAK1、CAK2和CAK3的相似性高达94.32%、97.49%和86.57%;RT-qPCR分析表明,AaCaMK1、AaCaMK2和AaCaMK3在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中均显著上调表达(P<0.05),而且果蜡诱导作用更显著。其中AaCaMK1和AaCaMK2在附着胞形成时期(6 h)表达量为对照的1.51倍和3.05倍,而AaCaMK3在侵染菌丝形成阶段(8 h)表达量最高,为对照的2.86倍,并且在果蜡诱导下,这3个基因在芽管伸长阶段(4 h)的上调表达量显著高于疏水界面。【结论】钙信号中AaCaMK基因在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中发挥重要的调控作用。