肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体DK-13的生物学特性及应用

【目的】筛选并分离出能裂解肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体,分析其生物学特性,并探究其对污染猪肉的杀菌作用。【方法】采用双层平板法分离鉴定噬菌体,并测定其最佳感染复数,一步生长曲线等,对其基因组进行测序分析以及裂解功效的测定。【结果】从医院污水中分离鉴定能特异裂解肠侵袭性大肠埃希菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)的噬菌体并命名为DK-13,其呈典型的蝌蚪状外形,包含一个正二十面体的头部和一个可收缩的螺旋对称的尾部,属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体;生物学特性表明:最佳感染复数为0.01,潜伏期约为10 min,裂解期约为70 min,噬菌体DK-13能在50℃,pH 5.0-10.0条件下存活。全基因组测序表明,噬菌体基因组长约172 275 bp,GC含量为40.18%,预测其共有293个开放阅读框(open reading frames,ORF),未发现已知耐药基因和毒力基因。应用试验表明:被污染的猪肉中表现的杀菌效果良好,宿主菌的数量明显减少。【结论】分离并鉴定一株新的烈性噬菌体DK-13,DK-13具有潜伏期短、裂解效率高等优势,在食品安全方面具有很大应用潜力。

肠道侵袭性大肠埃希氏菌可视化环介导等温扩增方法的建立

肠道侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)是一种重要的食源性致病菌,可引起人类肠道疾病。本研究建立可视化环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法,针对EIEC特异性基因ipaH设计引物,优化反应条件,并对该方法的特异性、灵敏度进行评估。结果显示,所建立的LAMP方法在63℃反应45 min后可凭肉眼或紫外光下观察判定结果,对EIEC的检测灵敏度可达10 pg·μL^(-1)。该方法特异性良好,与其他常见肠道致病菌,如沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应。本研究建立的可视化LAMP方法快速、灵敏度高、对设备要求低,可满足现场快速检测需求。

一次食物中毒相关的侵袭性大肠杆菌分子分型分析

目的对一起食物中毒分离的病原菌进行鉴定、毒力基因检测及分子分型。方法利用生化试验、血清学试验对病原菌进行鉴定,用普通PCR和real-time PCR对病原菌进行毒力基因检测,用PFGE对其同源性进行分析。结果分离的12份病原菌均为Escherichia coli I,血清型为EIEC O136K78,12份病原菌均携带uid、ipaH基因,其中5份检测携带vir基因。PFGE电泳图谱显示12株病原菌带型完全相同,表明来源于同一克隆株。结论分子生物学技术与传统方法的有机结合对侵袭性大肠埃希菌的快速鉴定及分子分型具有重要意义。

一株与侵袭性大肠埃希菌O144诊断血清交叉凝集的蜂房哈夫尼亚菌

[目的]对试验中发现的一株与EIEC诊断血清O144:K?发生凝集反应的蜂房哈夫尼亚菌进行较详细的生化与血清学鉴定,为今后的相关细菌鉴定工作提供参考。[方法]参考国家食品卫生检验标准微生物分册GB/T4789-2003、临床微生物手册中的相关方法进行。[结果]该蜂房哈夫尼亚菌菌株生化不典型,且与EIEC O144:K?血清型存在交叉凝集反应。[结论]该菌株为蜂房哈夫尼亚菌中少数的、生化不典型的菌株,若不进行较详细的生化鉴定易误检为EIEC O144:K?。

肠侵袭性大肠埃希氏菌国家核酸标准样品的研制

目的研制肠侵袭性大肠埃希氏菌核酸标准样品,并对其均匀性和稳定性进行评价。方法本文研究了肠侵袭性大肠埃希氏菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术,定值技术和定值方式,开展均匀性和稳定性试验,并对食品中肠侵袭性大肠埃希氏菌核酸标准样品的不确定度进行确定;标准样品采用Pico Green DNA分子荧光定量方法进行定值。多家单位合作定值,确定标准样品的标准值及其不确定度。结果标准样品均匀性标准不确定度为0.016%,不稳定标准差为0.0100,均匀性和稳定性试验结果表明,本文研制的标准样品均匀且稳定。结论研制出具有溯源性的肠侵袭性大肠埃希氏菌核酸标准样品并获得国家标准样品证书,可适用于肠侵袭性大肠埃希氏菌的检测和质量控制。

侵袭性大肠杆菌烈性噬菌体的筛选及其对宿主菌的抑制效应观察

目的在环境水体中筛选高裂解效应的侵袭性大肠杆菌噬菌体,观察其抑制宿主菌的规律,探讨食品加工和储存中的抑菌处理方法。方法采用双层平板铺板法、噬菌斑计数法及电镜技术筛选高裂解度噬菌体并对其宿主谱、形态,以及对牛奶中宿主菌的抑制规律进行了观察。结果筛选所得的噬菌体LSB-1形态似葫芦状,由两个圆形衣壳体单位组成,噬菌斑透明且无光晕;其对侵袭性大肠杆菌8401株可产生特异性裂解作用。该噬菌体在4℃条件下作用2～12h,可使牛奶中侵袭性大肠杆菌8401株滴度降低2个对数值;在22℃条件下作用8h、37℃～40℃条件下作用4h,宿主菌滴度降低均可达到4个对数值;但在高于4℃条件下,该噬菌体均随着时间的延长而抑菌作用减弱。结论噬菌体LSB-1对宿主菌有特异的裂解作用,通过与其他烈性噬菌体组合并在充分验证其安全性的条件下可作为食品类物质的生物抑菌剂进行进一步探讨。

PCR检测志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H基因

目的 建立一种志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的PCR诊断方法。方法 根据志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因序列 ,设计一对引物 ,优化各种工作条件 ,建立一种PCR诊断方法。结果 本法特异性好 ,敏感性可达 10CFU ,整个实验过程在 6～ 7h内完成。结论 建立的方法在理论和实际应用上都有优越性 。

一起水源型引起肠侵袭性大肠埃希菌暴发疫情的调查研究

目的查明一起幼儿园腹泻暴发疫情的病原学和流行因素。方法从患者粪便中分离培养获得的菌株进行血清学、生化、PCR毒力基因检测和分子分型。从流行病学调查和病人的三间分布分析引起暴发的原因。结果从20份病人粪便中分离到10株菌株,根据生化特性、噬菌体裂解试验、ipaH检测和ERIC-PCR图谱确定为肠侵袭性大肠埃希菌。引起暴发流行的原因为该镇的部分生活污水污染幼儿园的生活用水所致。结论本起腹泻暴发疫情为幼儿园生活用水污染引起的肠侵袭性大肠埃希菌暴发流行;在细菌性痢疾暴发流行时,应该与肠侵袭性大肠埃希菌进行病原学鉴别诊断。

肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

目的为建立肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）的DPO-PCR快速检测方法。方法本研究以EIECipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了EIEC DPO-PCR检测方法。结果退火温度范围在47℃~67℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.17×102 cfu/mL。利用该检测方法对采集的230份样品进行检测,共计检出3份EIEC阳性样品,与国标法（GB 4789.6-2003）检测结果一致,显示了良好的实用性。结论该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。

特异血清吸附模板聚合酶链反应检测肠侵袭性大肠杆菌的研究

目的 建立检测与鉴定肠侵袭性大肠杆菌的新方法。方法 应用特异血清吸附模板聚合酶链反应 (SSST .PCR)检测肠侵袭性大肠杆菌。结果 与经典的分离培养法比较 ,此方法大大缩短了时间 ,由原来的 7天左右缩短到了 6～ 8小时 ;与单纯的PCR法比较 ,简化了DNA提纯的过程 ,并能进行分型。结论 SSST .PCR法是一种简单、快速、特异和敏感的新方法。

侵袭性大肠埃希菌引起群体食物中毒的实验室快速分析

目的快速分析由微生物引起的71人群体食物中毒的病原菌。方法按GB／T4789．1—14—2003、微生物学及微生物学检验中的方法。结果结合71名食物中毒患者的流行病学调查，样品采集24h后即有了目标菌的初步结果，最后结果与初步结果相符。结论这是一起由侵袭性大肠埃希菌引起的食物中毒。在优势菌生长旺盛的情况下，样品检测可以快速确定初步结果，为事故处理提供参考依据。