PCR检测志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H基因

目的 建立一种志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的PCR诊断方法。方法 根据志贺菌和侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因序列 ,设计一对引物 ,优化各种工作条件 ,建立一种PCR诊断方法。结果 本法特异性好 ,敏感性可达 10CFU ,整个实验过程在 6～ 7h内完成。结论 建立的方法在理论和实际应用上都有优越性 。

志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌LAMP检测方法的建立及应用

目的建立针对侵袭性质粒抗原H(ipaH)编码基因的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法利用LAMP方法对4株志贺菌、1株肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和20株其他肠道菌DNA在65℃恒温扩增30min或60min后观察结果。结果 4株志贺菌和EIEC可通过肉眼和电泳观察到阳性结果,而其他肠道菌为阴性。LAMP检测特异性与聚合酶链反应(PCR)相似,但敏感性比PCR高10倍。LAMP、PCR检出下限分别为1.2×102、1.2×103CFU/mL。LAMP和分离培养法对70例食物中毒患者和健康者肛拭子标本检测结果符合率为100%。结论 LAMP由于具有快速和无需特殊仪器的优点,可广泛用于肛拭子标本志贺菌和EIEC的检测。

志贺菌6种毒力基因的多重PCR检测

目的:建立志贺菌6种毒力基因[志贺菌肠毒素1基因(set1)、志贺菌肠毒素2基因(sen)、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关蛋白基因(ial)、志贺毒素1基因(stx1)及调控基因(virA)]的多重PCR鉴定方法,实现多基因的同时检测。方法:选择志贺菌的6种毒力基因作为靶基因,以A群和C群4株标准及B群和D群4株临床分离株为模型,应用降落PCR方法在1个反应管中同时进行扩增,根据扩增片段大小定性判断结果。通过样本倍比稀释检验多重PCR的灵敏性,并在NCBI网站上用BLAST检索各引物的特异性。另选取河南省2001年至2007年115株志贺菌进行多重PCR检测,以验证多重PCR的可行性。结果:多重PCR能同时检测上述6种毒力基因,与单基因PCR分别检测6种毒力基因相比具有相近的灵敏度与特异性。应用多重PCR方法检测115株志贺菌,除stx1外,其余5种毒力基因的阳性率均在85%以上。结论:多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究。

应用DPO-PCR方法特异性检测志贺氏菌

本研究利用一种高特异性PCR引物设计方法——双启动寡核苷酸引物（dual-primingoligonucleotide，DPO），以志贺氏菌属侵袭性质粒抗原（ipaH）基因为靶基因，设计DPO引物，建立了特异性检测志贺氏菌属的DPO—PCR方法。结果显不，所建立的DPO-PCR方法检测灵敏度为1．65×10^2CFU／mL；与常规PCR引物相比，DPO引物设计简易，简化了PCR引物设计；DPO引物退火温度范围宽，在50-70℃退火温度内均可对靶基因进行高效扩增；DPO引物结构特殊，具有比常规PCR引物更高的特异性，反应中无非特异性扩增产生。实践检测结果显示，利用该方法对133份冻／鲜肉类、果蔬类、鲜牛奶、鸡蛋和熟食样本进行检测，共检出15份志贺氏菌阳性样本，经国标法（GB／T4789．5-2012）复检，两者检测结果一致，显示出良好的实用性和可靠性，为志贺氏菌快速、准确的检测提供了新手段。

PCR方法检测志贺氏菌的研究

建立一种快速检测志贺氏菌PCR检测方法。根据志贺氏菌的侵袭性质粒抗原 (ipaH)基因序列 ,设计引物 ,建立PCR检测方法。本方法特异性高 ,均能检测出志贺氏菌属的 4个种 ,整个实验过程 8～ 10h完成。建立的方法可用与实际检测中。

PCR技术快速检测痢疾志贺菌的研究

目的快速、准确检测食品中的痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)感染。方法针对痢疾志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)设计引物,通过对PCR扩增体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、酶用量、退火温度和循环数进行优化,建立痢疾志贺菌PCR快速检测方法,并对其特异性、敏感性进行分析。结果该方法检测的特异性好,痢疾志贺菌纯培养物和基因组DNA的灵敏度分别为1.06×102cfu/ml和106.34pg/PCR反应体系;直接检测模拟食品中的痢疾志贺菌,其检出限为3.21×104cfu/ml。结论该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,适用于快速、准确检测食品中致病菌的污染。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌

【目的】将环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）联合应用,建立一种可应用于志贺氏菌快速检测的LAMP-LFD技术。【方法】以福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H（ipa H）基因为检测靶标设计3对特异性引物（其中上游内引物Sfl-ipa H-FIP由生物素标记）,进行LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针Sfl-ipa H-HP,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。【结果】优化后的LAMP反应条件为63℃ 40 min,加上LFD结果判读共需50 min。LAMP-LFD方法能够特异性检测出福氏志贺氏菌,而对肠炎沙门氏菌等其它4种导致腹泻的致病菌和创伤弧菌等5种常见食物源性致病菌,以及4株不同大肠杆菌的检测结果呈阴性。该方法针对福氏志贺氏菌的检测灵敏度为1.0×10^2 CFU/m L或4 CFU/反应,针对人工污染鲤鱼肠组织的检测灵敏度是5.0×10^2 CFU/m L,是以LAMP外引物Sfl-ipa H-F3/Sfl-ipa H-B3的常规PCR方法的100倍。【结论】建立的LAMP-LFD技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,有望在志贺氏菌的常规监测和即时检测中被普及使用。

环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法研究

目的对环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法进行研究和评价。方法根据痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasion plasmid antigen H,ipa H)基因设计引物,利用普通PCR方法扩增其ipa H基因并将其与T载体进行连接以获得ipa H-T重组质粒;对重组质粒进行梯度稀释后进行荧光定量PCR,观察其标准曲线及最低检出限;提取17株可在环境水样中存在的多种致病菌DNA并以同样反应体系进行荧光定量PCR,验证该方法的特异性;将痢疾志贺菌加标于地表水水样中,测试该方法的环境样品检测能力。结果成功扩增痢疾志贺菌ipa H基因并连接T载体;通过荧光定量PCR检测各梯度浓度重组质粒的Ct值间隔相近,检出限低至10 copies;17株致病菌DNA的检测结果均为阴性,显示该方特异性好;在环境地表水菌落总数为3.5×103 CFU/ml、痢疾志贺菌加标浓度低至5 CFU/ml时,仍可以通过该方法检出,显示该方法的抗干扰能力强,可用于环境水样的直接检测。结论通过荧光定量PCR方法可实现对水中痢疾志贺菌进行快速检测,检测时限3 h以内,检测浓度5 CFU/ml,特异性及抗干扰性好,可用于污染水样的快速直接检测。

重组酶聚合酶扩增方法快速检测志贺菌

目的建立一种重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测志贺菌。方法依据志贺菌属侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因的保守序列设计特异性引物,建立RPA检测方法;通过检测梯度稀释的志贺菌标准菌株DNA,评价RPA的灵敏度;通过检测志贺菌、出血性大肠埃希菌O157:H7、沙门菌、副溶血弧菌、粪肠球菌评价RPA的特异性。结果建立的RPA方法在35℃反应20min,即可检测到志贺菌ipaH基因,检测灵敏度为10ng/μl志贺菌基因组DNA,比PCR高100倍;且与其他肠道病原菌无交叉反应。结论本研究建立的志贺菌RPA检测方法敏感性、特异性强,操作简单快速,为志贺菌的现场快速检测提供一种新思路。