重组沙门菌侵袭蛋白A的原核表达与纯化

目的在大肠杆菌中表达重组沙门菌侵袭蛋白A,并对表达产物进行分离和纯化。方法提取沙门菌基因组模板,PCR扩增侵袭因子invA基因目的片段,插入表达质粒载体pET-30c(+)中,构建pET-invA重组子,经双酶切和测序证实后,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Westernblot检测鉴定表达蛋白。结果成功构建了沙门菌pET-invA大肠杆菌表达重组子,实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达,分离纯化的表达产物纯度达到电泳纯。结论沙门菌侵袭蛋白A的成功表达和分离纯化,为该蛋白的免疫学性能研究、相应抗体的制备以及沙门菌快速检测方法的建立奠定了基础。

假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.

T淋巴细胞侵袭转移诱导蛋白1在小鼠子宫内膜基质细胞-胚泡共培养体系中对胚泡黏附的影响

目的：检测不同浓度T淋巴细胞侵袭转移诱导蛋白1（Tiam1）抗体下，小鼠着床窗子宫内膜基质细胞内的Tiam1蛋白表达及其对基质细胞-胚泡共培养体系中胚泡黏附的影响，探讨Tiara1对小鼠胚胎着床的影响。方法：提取着床窗小鼠子宫内膜基质细胞并构建基质细胞-胚泡共培养体系；分别用免疫细胞化学和免疫印迹法检测不同浓度抗Tiam1抗体时着床窗基质细胞Tiam1蛋白的表达及其对胚泡黏附的影响。结果：抗体干预后着床窗基质细胞内的Tiam1蛋白表达水平降低；在不同抗体浓度下胚泡黏附率有差异。结论：随Tiam1抗体浓度增加，着床窗小鼠子宫内膜基质细胞Tiam1蛋白表达量及胚泡黏附率降低。表明Tiam1可能在胚泡植入过程起重要的作用。

迁移侵袭抑制蛋白对人脐静脉内皮细胞生物学行为的作用

目的:研究迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein,MIIP)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖能力、迁移侵袭能力等生物学行为的影响。方法:采用瞬时转染的方式在HUVEC中过表达MIIP,经蛋白质印迹(Western-blot)实验鉴定MIIP和VEGFR2的表达水平;采用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethyny-2’-deoxyuridine,EdU)法检测MIIP对HUVEC增殖能力的影响,采用划痕愈合实验和穿透小室实验检测MIIP对HUVEC迁移侵袭能力的影响,采用小管形成实验检测HUVEC体外成管能力的变化,采用基质胶栓实验观察MIIP对HUVEC体内血管新生能力的影响。结果:通过瞬时转染可使MIIP在HUVEC中的表达上调2.8倍。与空载体转染的细胞相比,过表达MIIP的HUVEC的划痕愈合能力减弱;空载体转染组及MIIP过表达组的HUVEC在迁移实验中的穿膜细胞数分别为(350±24)个和(167±29)个(P<0.01),在侵袭实验中的穿膜细胞数分别为(434±12)个和(286±8)个。在体外小管形成实验中形成的小管数分别为(27±4)个和(13±2)个。EdU阳性标记的细胞比例在2组分别为63%±4%和61%±2%。基质胶栓实验显示,过表达MIIP后,HUVEC的体内血管新生能力下降。蛋白质印迹结果显示,MIIP能够下调HUVEC中血管内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)的表达。结论:MIIP能够抑制HUVEC的迁移侵袭能力、体外成管能力及体内血管新生能力。

迁移侵袭抑制蛋白在肾细胞癌及癌旁肾组织中的表达

目的:探讨迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitor protein,MIIP)在肾细胞癌及癌旁正常肾组织中的表达及临床意义。方法:收集临床确诊肾细胞癌病理组织84例,包含癌组织及癌旁正常肾组织,进行石蜡包埋切片和免疫组织化学SP法染色,观察分析MIIP在肾细胞癌及癌旁正常肾组织中的表达情况。结果:MIIP在肾细胞癌组织中的阳性表达率为30.95%,在癌旁正常肾组织中的阳性表达率为85.71%(P<0.05),差异具有统计学意义;肾细胞癌临床分期中MIIP阳性表达率分别为Ⅰ期54.55%,Ⅱ期40.54%和Ⅲ期13.89%,Ⅲ期分别与Ⅰ期、Ⅱ期相比较阳性表达率差异有统计学意义,Ⅰ期与Ⅱ期比较阳性表达率差异无统计学意义。结论:MIIP在肾细胞癌组织中的表达量较癌旁正常肾组织减少,其程度与肿瘤的恶性程度及侵袭迁移有关。

迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定共表达HCT116^(MIIP-Luc)结肠癌细胞系的建立

目的建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系,为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法将MIIP基因插入慢病毒载体p LEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体p LEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体p LEX-MCS-HA-MIIP及包装载体VSVG、△8.9,共转染HEK293T细胞,包装表达MIIP的慢病毒,将其感染HCT116细胞后,采用适宜浓度的嘌呤霉素筛选,建立MIIP稳定过表达的HCT116细胞。利用表达荧光素酶报告基因的慢病毒进行二次感染,建立MIIP和荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞。利用实时荧光定量PCR检测MIIP的mRNA水平,Western blot法检测MIIP蛋白水平,小动物活体成像技术观察HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞的荧光强弱。结果成功建立了MIIP荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞,在HCT116MIIP-Luc细胞中实现了MIIP过表达,生物发光成像结果显示HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞均可产生较强的荧光。结论分别建立了可传代的MIIP过表达及荧光素酶报告基因稳定共表达的结肠癌HCT116细胞株。

迁移侵袭抑制蛋白在肿瘤发生发展中的作用及其临床意义

迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein,MIIP)能够与胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2)、组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)、p21活化激酶1、表皮生长因子受体、细胞分裂周期20(cell division cycle 20,cdc20)、拓扑异构酶等相互作用,抑制细胞增殖和迁移侵袭,进而抑制多种肿瘤的发生发展。最近的研究显示,MIIP还与病毒感染、细胞免疫有关。鉴于MIIP的作用涉及到多条肿瘤相关的信号通路及肿瘤治疗靶点,MIIP逐渐成为研究的热点。本文主要围绕MIIP的分子特征、功能和在多种肿瘤中的临床意义及作用机制进行综述。

迁移侵袭抑制蛋白MIIP与肿瘤的研究进展

迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因是近年来新发现的一种抑癌基因,与多种人类肿瘤发生进展关系密切。它主要通过与胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGFBP2)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)结合调控肿瘤细胞的迁移、侵袭。本文主要围绕MIIP与肿瘤的关系,及其作用机制进行归纳总结。目的在全面了解MIIP对肿瘤影响的基础上,为抗肿瘤治疗提供新思路辅助临床治疗。

大肠癌裸鼠移植瘤实验模型的建立及T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1封闭载体的治疗作用

目的通过建立大肠癌SW620细胞裸鼠皮下移植瘤模型，观察T细胞淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1（Tiaml）封闭载体在动物体内的治疗作用。方法构建编码一条短发夹RNA的Tiaml质粒表达封闭载体，并用之转染SW620细胞；应用Hoechst33342荧光染色技术观察细胞形态学变化。将皮下接种SW620细胞的裸鼠分为3组，每组8只，在接种后第2周分别瘤内注射生理盐水（对照组）、HK错配链（HK组）和Tiaml封闭载体（Tiaml组）。第16天处死各组裸鼠，取出移植瘤移重。结果通过DNA测序证实封闭载体构建成功。SW620细胞经Tiaml封闭载体转染后，细胞核可见凋亡小体。对照组平均移植瘤重量（2．84±0．27）g，HK组（2．89±0．18）g，Tiaml组（1．47±0．20）g，Tiaml组与其他2组比较差异有统计学意义（P〈0．01），而HK组和对照组之间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论所构建的Tiaml封闭载体能有效抑制大肠癌裸鼠皮下移植瘤生长。

阿尔茨海默病与蛋白侵袭子疾病

在蛋白侵袭子(朊病毒)疾病中,当正常形式的朊病毒蛋白(PrP—C)开始与异常形式的朊病毒蛋白(PrP—Sc)直接接触时,可发生构象上的改变并转化为PrP—Sc。这种淀粉样的蛋白不易被破坏并能形成有损伤性的斑块。现在科学家们发现,阿尔茨海默病的神经变性机制之一可能也涉及到淀粉样β蛋白(Aβ)与较大的淀粉样前体蛋白(APP)

水通道蛋白-5对结直肠癌淋巴结转移的作用及机制

目的检测水通道蛋白-5(AQP-5)在结直肠癌中的表达情况,分析TAZ与肿瘤淋巴结转移情况及患者预后的关系;同时检测肿瘤侵袭转移蛋白金属基质蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白的表达,并对其意义进行分析。方法收集98例区域淋巴结转移阳性的结直肠癌及40例癌旁正常组织石蜡组织标本,免疫组化(SP)染色检测AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表达情况。记录患者的临床资料并进行随访,分析AQP-5对结直肠癌淋巴结转移及预后的意义,并对AQP-5与肿瘤侵袭转移蛋白的关系进行分析。结果AQP-5、MMP-2、MMP-9在肿瘤组织中表达高于癌旁组织,TIMP-1、TIMP-2表达则低于癌旁组织(P<0.05)。AQP-5、MMP-2蛋白表达水平均与淋巴结转移数目呈正相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,AQP-5阳性者生存期较短(P<0.05)。在结直肠癌组织中AQP-5与MMP-2、MMP-9、TIMP-1之间均有相关性(P<0.05)。结论AQP-5蛋白可促进结直肠癌的淋巴结转移,AQP-5阳性是患者预后较差的标志。AQP-5的这种作用可能是通过调节侵袭转移蛋白实现的。

益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞系增殖侵袭能力及miR-100表达水平影响的研究

目的:探讨益气活血方对乳腺癌MCF-7细胞系增殖侵袭能力及microRNA-100(miR-100)表达水平的影响。方法:取对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞,将益气活血方以培养液稀释调整为20、40、80 mg/L培养细胞,设置高、中和低浓度组,并以不含药物的相同培养液培养细胞为对照组。分别采用qRT-PCR检测miR-100的表达水平;MTT法检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭;并采用Western blot法检测细胞增殖相关蛋白特异性周期蛋白D1(Cyclin D1)和侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平。结果:与对照组相比,实验组miR-100表达水平升高;且与较低浓度组相比,较高浓度组miR-100表达水平亦呈上升趋势(均P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞增殖抑制率和侵袭抑制率明显升高,且与较低浓度组相比,较高浓度组各抑制率均亦呈上升趋势(均P<0.05)。同时,与对照组相比,实验组Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平明显降低,且与较低浓度组相比,较高浓度组Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平亦呈下降趋势(均P<0.05)。结论:益气活血方可抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。其机制可能与益气活血方可提高miR-100表达水平、降低Cyclin D1和MMP-9表达水平相关。

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建

为研制表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白的重组腺病毒疫苗,根据PCV-2ORF2(Cap)基因序列和耶尔森菌侵袭素C端(InvC)序列,克隆获得Cap和InvC基因后,插入pAdShttle-CMV载体构建重组穿梭载体pAdShttle-Cap-InvC,经PmeI线性化后,转化入BJ5183感受态细菌与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-Cap-InvC。重组质粒经PacⅠ线性化后,转染HEK293细胞,连续传代后获得重组腺病毒。应用PCR、Western blot和间接免疫荧光(IFA)技术分别检测重组腺病毒中Cap和InvC基因及表达。结果表明,成功构建了表达PCV-2Cap蛋白和InvC的重组腺病毒rAd-CapInvC,经过噬斑纯化和连续传代,重组腺病毒TCID50可达10-9.32/mL,为PCV-2重组腺病毒活载体疫苗的研发提供了基础材料。

MIIP对膀胱癌T24细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制作用及其机制

目的:探讨迁移侵袭抑制蛋白(migration invasion inhibitory protein,MIIP)对膀胱癌T24细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及作用机制。方法:设计并合成MIIP过表达质粒,并利用脂质体转染方法上调T24细胞系中MIIP的表达。Western blot及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测过表达MIIP的效果,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)及平板克隆法观察MIIP过表达对T24细胞增殖能力的影响,划痕及Transwell实验检验MIIP过表达对T24细胞迁移侵袭能力的影响。Western blot及Real-time PCR检测过表达MIIP后其上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程相关标志物钙黏蛋白E(E-cadherin)、钙连蛋白N(Ncadherin)、转录因子Snail蛋白和mRNA变化情况。结果:过表达质粒能有效上调T24细胞系中MIIP蛋白及mRNA的表达,上调MIIP表达后T24细胞增殖能力明显下降,克隆形成能力下降,迁移侵袭能力减弱;上调MIIP表达后E-cadherin表达增加,N-cadherin及转录因子Snail表达减少。结论:过表达MIIP可能通过降解转录因子Snail,从而抑制EMT进程降低膀胱癌T24细胞的增殖及迁移侵袭能力。

MIIP对肾癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响

目的:利用质粒转染技术制备过表达迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein,MIIP)的肾癌786-0/MIIP细胞系,观察MIIP对细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法:构建携带MIIP基因的质粒,通过脂质体质粒转染技术上调肾癌786-0细胞系MIIP基因表达。Western-blot、Real-time PCR检测转染效果;利用MTT实验检测MIIP对786-0细胞增殖能力的影响;Transwell实验、划痕实验检测MIIP对786-0细胞侵袭、迁移能力的影响。结果:Western-blot、Real-time PCR检测发现实验组786-0/MIIP细胞MIIP蛋白及mRNA表达量有效上调。MTT实验显示实验组786-0/MIIP细胞增殖能力明显减弱(P<0.01)。Transwell实验显示实验组786-0/MIIP细胞侵袭能力减弱,穿透小室细胞数明显减少(P<0.01)。细胞划痕实验显示实验组786-0/MIIP细胞迁移能力显著下降(P<0.01)。结论:通过质粒转染技术能够制备过表达MIIP的肾癌细胞系。转染成功的肾癌786-0/MIIP细胞系MIIP表达量增加,有效抑制了肾癌细胞的增殖、侵袭与迁移。

β3GnT8基因对HL60细胞体外侵袭能力的影响

目的：初步探讨β3GnT8/GalT7基因对HL60细胞体外侵袭的作用。方法通过脂质体介导将实验室构建好的β3GnT8真核正义表达载体pEGFP-C1-T8-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T8-AntiSense转染入HL60细胞；RT-PCR和Western blot检测浸润转移相关的功能基因TGFβ1、MMP2、MMP14在mRNA水平和蛋白质水平的表达变化；Transwell侵袭实验检测β3GnT8对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果随着β3GnT8表达上调，细胞侵袭能力高于对照组（P＜0.05），MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达上调，而TGFβ1表达下调；随着β3GnT8表达下调，细胞侵袭能力下降，MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达下调，而TGFβ1表达上调。结论β3GnT8可在体外增强HL60细胞的侵袭能力，而该作用可能源于它能够诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达变化。

MIIP通过HDAC6参与肿瘤侵袭转移的研究进展

迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion inhibitory protein,MIIP),是近年来研究发现的潜在肿瘤转移抑制基因,定位于1p36,该区域在多种肿瘤中缺失。MIIP的定位提示其可能在肿瘤侵袭、转移中发挥作用,并且已有研究报道MIIP可抑制胶质瘤及乳腺癌的侵袭转移。本文就MIIP通过HDAC6在肿瘤侵袭转移中的作用及其分子机制作一综述。

贵州矮马鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及其致病力研究

为了探究贵州矮马的腹泻病原,试验以腹泻粪样为材料进行病原菌的分离鉴定。经SS和XLD培养基筛选,得到1株菌株S6,经革兰氏染色、生理生化检验以及16SrRNA基因序列比对分析,S6菌株可在SS和XLD琼脂培养基表面生长,革兰氏染色呈阴性;生理生化检验结果与沙门氏菌的生化特性相符;16SrRNA基因序列与已知的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311（登录号：NR_119108）的亲缘关系最近,序列同源性为99%。形态学和分子系统学分析表明,该菌株为鼠伤寒沙门氏菌。采用PCR方法从S6菌株基因组中得到侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）基因,与已知基因序列有6～8bp不一致,编码的氨基酸发生了一个替换。通过改良寇氏法测定S6菌株对小鼠的半数致死量（LD50）为4.71×102 CFU,属于强致病力菌株。推测S6 invA基因的变异可能与菌株的毒力强弱有关。贵州矮马群体中沙门氏菌的检出率为57%。本研究提示贵州矮马的腹泻病原之一可能是强毒力的鼠伤寒沙门氏菌。

迁移侵袭抑制蛋白和p21活化激酶1在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的探讨迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）和p21活化激酶1（PAK1）在子宫内膜癌组织中的表达，分析其与子宫内膜癌患者临床病理特征及预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测135例子宫内膜癌、55例不典型增生和88例正常子宫内膜组织中MIIP和PAK1蛋白的表达，分析子宫内膜癌组织中MIIP和PAK1蛋白表达的临床意义及二者的相关性。 结果正常子宫内膜组、不典型增生组和子宫内膜癌组MIIP的阳性表达率分别为52.3%（46/88）、41.8%（23/55）和34.8%（47/135），子宫内膜癌组明显低于正常子宫内膜组（P〈0.05）。MIIP蛋白的表达与肌层浸润、国际妇产科联盟（FIGO）分期和淋巴结转移情况有关（均P〈0.05）。正常子宫内膜组、不典型增生组和子宫内膜癌组的PAK1阳性表达率分别为45.5%（40/88）、50.9%（28/55）和62.2%（84/135），子宫内膜癌组显著高于正常子宫内膜组（P〈0.05）。PAK1蛋白的表达与组织学分级、肌层浸润、FIGO分期和淋巴结转移情况有关（均P〈0.05）。MIIP和PAK1蛋白的表达与患者的累积生存率无关（P值分别为0.092和0.052）。子宫内膜癌组织中MIIP与PAK1蛋白的表达呈负相关（r=-0.329，P〈0.001）。结论MIIP的低表达和PAK1的过表达共同参与了子宫内膜癌的发生、发展，与子宫内膜癌的不良预后有关。MIIP和PAK1蛋白在子宫内膜癌中的表达呈负相关。

两株双价痢疾工程菌苗不同粘膜免疫途径的免疫原性

目的探讨免疫途径、接种剂量及侵袭蛋白表达对两株双价痢疾工程菌苗免疫效果的影响。方法小鼠分为滴鼻、灌胃和对照组 ,分别以不同剂量免疫 3次 ,间隔 2周 ,3次免疫后 7d收集血清、小肠、鼻咽、肺、阴道冲洗液 ,EL ISA法检测其中特异性福氏、宋内氏 L PS- Ig A和 Ig G。结果 4× 10 7CFU菌苗经鼻途径免疫即可诱导多个粘膜部位以及血清双价特异性抗体显著增高 ;菌苗剂量增加 2 0、2 0 0倍时经灌胃免疫诱发较为局限的粘膜特异性抗体增高。结论鼻粘膜免疫不仅诱导多个粘膜部位 (特别是生殖道 )以及系统免疫的抗体反应 ,是一个安全有效的免疫途径。