荧光报告质粒构建及其在布鲁菌细胞侵袭试验中的应用

采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBR1MCS-2经KpnⅠ酶切后连接,转化DH5α,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A.1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。

小白鼠替代豚鼠作角膜侵袭试验

小白鼠替代豚鼠作角膜侵袭试验闫成秀（阜阳市卫生防疫站２３６０１０）志贺氏菌属感染豚鼠角膜可以产生特异性的角膜炎。因此，传统上把豚鼠角膜侵袭试验作为鉴定志贺氏菌属侵袭毒力的常规方法。但是，豚鼠形体较大，饲养代价较高，而且来源及尸体处理也有一定的困难。有...

β-榄香烯对肝癌细胞SK-hep-1的迁移和侵袭力的影响

目的:观察β-榄香烯对肝癌SK-hep-1细胞的侵袭、转移等生物学行为的影响,探讨其对MMP2基因的调节。方法:将SK-hep-1细胞分为3组:control组、β-榄香烯(80μg/ml)组、TGF-β1(transforminggrowth factorβ1,TGF-β1)(10μg/ml)组,RT-PCR检测各组细胞的MMP2(matrix metalloproteinase-2,MMP2)mRNA表达;通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对β-榄香烯作用的肝癌细胞迁移和侵袭能力进行分析。结果:β-榄香烯作用肝癌细胞中MMP2mRNA表达低于control组和TGF-β1组(P<0.05)。β-榄香烯组穿膜细胞数(50±10)少于control组(150±16)及TGF-β1组(300±13),(P<0.05)。β-榄香烯组细胞的迁移数(92±8)明显低于control组(180±14)及TGF-β组(300±20),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:β-榄香烯能下调肝癌细胞SK-hep-1的MMP2mRNA表达,降低肝癌细胞的侵袭、迁移能力。

长链非编码H19靶向调节miR-107通过Notch通路对肺癌的侵袭迁移的影响

目的:探讨长链非编码H19靶向调节miR-107通过Notch通路对肺癌的侵袭迁移的影响情况。方法:q PCR检测肺癌和癌旁组织、不同肺癌细胞中H19的表达情况;Transwell侵袭实验检测沉默H19后肺癌细胞侵袭能力的变化;划痕实验检测沉默H19后肺癌细胞迁移能力的变化;双荧光素酶报告基因检测H19与miR-107的相互作用;q PCR检测肺癌和癌旁组织、不同肺癌细胞中miR-107的表达情况;Transwell侵袭实验检测沉默H19后miR-107对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测沉默H19后miR-107肺癌细胞迁移能力的影响;裸鼠皮下成瘤检测沉默H19后miR-107对肺癌成瘤大小以及体积的影响。Western blot检测沉默H19后Notch通路蛋白的表达情况。结果:与癌旁组织相比,肺癌组织中H19表达明显增高;肺癌细胞A549中H19表达水平最高;沉默H19可以抑制肺癌细胞侵袭和迁移能力;H19能与miR-107的3'UTR特异性结合;与癌旁组织相比,肺癌组织中miR-107表达明显降低;沉默H19后,抑制miR-107可以促进肺癌细胞侵袭和迁移能力;与H19-siRNA组相比,H19-siRNA+miR-107-inhibitor组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量都明显增大。沉默H19后Notch通路蛋白表达情况相应下调。结论:H19在肺癌发生发展过程中起重要作用,H19可以靶向调节miR-107通过Notch信号通路调控肺癌细胞的侵袭和迁移能力。

MiR-26b靶向hENT1通过RhoA/ROCK-1通路调控肺癌细胞的侵袭和迁移

目的:探讨miR-26b在肺癌组织中的表达及miR-26b在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制。方法:q PCR检测肺癌和正常肺组织中miR-26b的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-26b与人平衡核苷转运蛋白1(human equilibrative nucleoside transporter 1,hENT1)的相互作用;Transwell侵袭试验检测miR-26b的表达对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕试验检测miR-26b的表达对肺癌细胞迁移能力的影响;Western印迹检测h ENT1,ROCK-1,Rho A蛋白的表达情况;鬼笔环肽染色观察miR-26b-mimic处理后细胞骨架的变化情况;裸鼠皮下成瘤试验检测miR-26b-mimic对肺癌成瘤大小及体积的影响。结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中miR-26b表达明显降低;且晚期、低分化和有淋巴结转移的肺癌组织miR-26b表达明显较早期、高分化和无淋巴结转移的肺癌组织低;miR-26b能与h ENT1的3'-UTR特异性结合;miR-26b可以调控肺癌A549细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-26b可以抑制h ENT1,ROCK-1,Rho A的表达;miR-26b-mimic处理后,F-actin染色明显减少,细胞膜皱褶形成明显减少,伪足形成明显减少;裸鼠皮下成瘤试验显示:miR-26b-mimic处理后肿瘤体积和质量明显减小。结论:MiR-26b在肺癌中表达明显降低,且跟肺癌分期、分级及淋巴结转移与否密切相关,同时靶向h ENT1通过Rho A/ROCK-1信号通路调控肺癌细胞的侵袭和迁移。

U0126对黑素瘤细胞A375侵袭的抑制作用

目的:评价U0126对人黑素瘤细胞A375侵袭的抑制作用。方法:人黑素瘤A375细胞在6孔细胞培养板中培养,加U0126处理过夜,然后通过观察A375细胞的细胞形态、细胞移动及细胞侵袭判断U0126对A375细胞的抑制。蛋白电泳试验检测U0126对黑素瘤细胞A375的ERK1/2蛋白磷酸化的影响。结果:U0126诱导A375细胞产生肌动蛋白(actin)张力丝,导致细胞形态改变;A375细胞的移动和细胞侵袭被抑制。结论:U0126可能通过抑制黑素瘤的ERK1/2蛋白的磷酸化从而抑制人黑素瘤细胞A375的侵袭。

多不饱和脂肪酸不同组分抑制肺腺癌干细胞作用研究

比较多不饱和脂肪酸(PUFA)各有效成分抑制肺腺癌干细胞增殖及迁移能力,筛选出最强组分,并探讨其量效关系.对肺腺癌细胞株A549及SPC-A-1进行无血清培养,待肿瘤干细胞(CSC)微球形成后,每日分别加入50μmol/L的α-亚麻酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、c9,t11-共轭亚油酸(c9,t11-CLA)和t10,c12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA),连续3d.分别行干细胞微球形成观察、干细胞微球定量分析,筛选出最强组分.加入不同浓度最强组分进行侵袭试验.干细胞微球定量分析显示:除LA外,EPA、DHA、c9,t11-CLA和t10,c12-CLA都可不同程度地抑制A549及SPC-A-1干细胞微球的形成.在两种细胞株中,与EPA及DHA组相比,同等浓度CLA组平均干细胞微球个数及单个微球干细胞密度均显著下降,表明两种CLA为抑制作用最强组分.选取最强组分CLA行侵袭试验,c9,t11-CLA、t10,c12-CLA均能不同程度地抑制肺癌干细胞的迁移及浸润能力,随着浓度的增加,抑制作用增加,两者混合物的抑制作用最强.结果说明,PUFA组分EPA、DHA、c9,t11-CLA和t10,c12-CLA对A549及SPC-A-1干细胞微球都有不同程度的抑制作用,其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA为最强组分.c9,t11-CLA和t10,c12-CLA体外试验能够不同程度的抑制肺腺癌干细胞的浸润和迁移能力,并具有剂量依赖性.

重组质粒pcDNA3.0-hugl-1转染结直肠癌细胞后生物学效应的观察

目的:观察外源基因hugl-1转染对结直肠癌LS174细胞生物学行为的影响,探讨hugl-1基因与结直肠肿瘤的相关性。方法:构建重组质粒pcDNA3.0-hugl-1,转染至结直肠癌细胞株LS174细胞中,RT-PCR、Western印迹检测转染后hugl-1 mRNA及蛋白的表达;通过软琼脂集落形成试验、划痕修复试验、细胞黏附试验及Transwell细胞侵袭试验等进一步对转染后LS174细胞增殖、黏附、运动和侵袭能力进行分析,并与空质粒载体及未转染LS174细胞作对照。结果:成功构建重组质粒pcDNA3.0-hugl-1;RT-PCR、Western印迹检测结果显示,重组体pcDNA3.0-hugl-1转染细胞株中hugl-1 mRNA及蛋白表达明显高于空载体转染及未转染组细胞(P<0.05)。重组体转染组细胞克隆形成率(32.23%)与未转染及空载体转染组细胞相比(35.76%、33.91%)无明显改变;重组体转染组LS174细胞克隆的迁移细胞数(82.14±7.62)明显低于空载体组(135.61±3.74)及未转染组细胞(142.37±6.12,P<0.05);转染后120min,重组体转染组LS174细胞克隆黏附力明显高于空载体组及未转染组(P<0.05);重组体转染组穿膜细胞数(63.7±8.0)明显少于空载体组及未转染组(158.3±16.5、156.3±13.0,P<0.05)。结论:人hugl-1基因表达上调能降低结直肠癌细胞迁移运动和侵袭能力,增加细胞黏附能力,但对肿瘤细胞增殖能力无明显影响;其表达降低可使肿瘤细胞播散。

痢疾杆菌体内诱导基因筛选方法的建立

分别用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)作为报告基因,用小鼠肺感染模型和HeLa细胞侵袭模型来试验筛选痢疾杆菌体内诱导基因的可行性。结果表明,以asd为报告基因,用HeLa细胞侵袭试验作为筛选模型,可成功地用于筛选痢疾杆菌的体内诱导基因。

内皮细胞对髓母细胞瘤干细胞特性的影响

目的探讨内皮细胞对髓母细胞瘤干细胞特性的影响及机制。方法实验分为3组,A组D341Med(D341髓母细胞瘤系);B组D341Med+HBMECsD341髓母细胞瘤系和人脑微血管内皮细胞(human brain microvasculature endothelial cells,HBMECs)共培养;C组D341Med+HBMECs+DAPTD341髓母细胞瘤系和人脑微血管内皮细胞以及γ-分泌酶抑制剂(DAPT)共培养,成球试验和流式细胞仪检测CD133+细胞,观察对肿瘤干细胞的影响。采用实时定量PCR和Western印迹法检测Notch(Notch 2、Jagded 1、Hes-1和Hey-2)mRNA和蛋白的表达,Transwell侵袭试验检测内皮细胞对肿瘤侵袭能力的影响,裸鼠成瘤试验观察肿瘤细胞的生长。结果与A组相比,B组成球数目和CD133+细胞增加(P<0.01),Notch相关mRNA和蛋白表达水平增加(P<0.05);Transwell侵袭试验显示,穿膜细胞数明显增高(P<0.05);裸鼠的肿瘤体积增大(P<0.05)。与B组相比,C组干细胞标记CD133+细胞急剧下降(P<0.05),Notch相关mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05);Transwell侵袭试验显示,穿膜细胞数明显下降(P<0.05);裸鼠的肿瘤体积缩小(P<0.05)。结论内皮细胞可能通过激活Notch通路调控髓母细胞瘤干细胞特性。

云南部队腹泻患者中首次检出EIEC O_(124):K_(72)

目的:了解EIEC O124:K72在云南部队引起腹泻的情况,对EIEC O124:K72进行分离鉴定。方法:分离培养,生化鉴定,血清分型,豚鼠角膜试验测定侵袭力,药敏试验采用K-B法。结果:从671份腹泻患者粪便标本中检出6株EIECO124:K72,所分离菌株均有较强的侵袭力,对17种抗生素敏感,1种耐药。结论:分离的6株EIEC O124:K72具有较强侵袭力,与致病性密切相关。药敏试验可作为此菌感染时临床用药的重要参考。