重组人凋亡诱导因子基因的构建、表达及其对HeLa细胞的促凋亡作用

凋亡诱导因子 (apoptosis inducingfactor ,AIF)定位于细胞的线粒体膜间隙 .当凋亡信号刺激时 ,AIF分子从线粒体释放到胞浆 ,然后转位到细胞核内 ,引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂 (～ 5 0kb) .用RT PCR法分段克隆得到人全长AIF基因 ,经改造截去其N端线粒体定位信号编码序列 ,代之以不同长度的绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域序列 .把这些重组基因克隆入 pIRES2 EGFP真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过荧光显微镜观察、共聚焦显微镜观察、电镜观察等方法检测了多种重组人AIF基因的表达及其对细胞生长的影响 .证明了重组人AIF基因的表达可引起HeLa细胞死亡 。

三七提取物对经MNNG转化后的GES-1细胞增殖抑制及促凋亡作用

目的通过细胞培养方法,研究灌服三七提取物后犬血清对胃癌前病变细胞增殖抑制及促凋亡作用。方法采用永生化的人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞被N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)进一步转化后的细胞(简称MC细胞)作为胃癌前病变细胞的体外研究模型;以三七提取物给彼格犬一次性灌胃,取给药前的血清及给药后不同时点的血清作为实验药物血清。以四甲基固氮唑盐(MTT)法分别检测每个采血时间点上含药血清对MC细胞作用72h后的抑制情况,找出最佳含药血清时点(2h、6h);根据以上结果,以流式细胞仪(flowcytometry)分别检测2h和6h药物血清对MC细胞作用72h后的促凋亡作用。结果2h和6h时点的药物血清对MC细胞的抑制率最高,分别达到45.3%和42.4%,与空白血清组比较差异有显著性(P<0.01);其能明显促进MC细胞的凋亡,与空白血清组比较其凋亡比例增加(P<0.05)。在2h和6h药物血清的作用下MC细胞在G0/G1期细胞比例明显下降(P<0.05);而G2/M期细胞显著增加(P<0.05);但S期并没有一致性的变化。结论灌服三七提取物后2h、6h药物血清对MC细胞的增殖抑制作用最强;均对MC细胞有显著的促凋亡作用,且能降低MC细胞在G0/G1期的比例及增加G2/M期的比例,这可能是其抑制MC细胞增殖及促凋亡的原因之一。

截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论

亚甲蓝对C6细胞的促凋亡作用及其与BCNU协同抗肿瘤作用的研究

目的 研究亚甲蓝对体外培养C6胶质瘤细胞的促凋亡作用及与化疗药物BCNU的协同抗肿瘤作用。方法 用荧光显微镜、透射电镜进行细胞凋亡形态观察 ;流式细胞术进行细胞周期解析 ;用RT PCR、Western blot进行凋亡相关基因bax、bcl xlmRNA和蛋白表达检测 ;观察MB和BCNU对Wistar大鼠C6胶质瘤模型的治疗效果。结果 MB(0 .1μg/ml)作用 2 4h使细胞发生典型的凋亡形态改变及明显的凋亡峰 ;baxmRNA和蛋白随MB作用时间延长而升高 ,bcl xlmRNA和蛋白随MB作用时间延长而下降。MB、BCNU联合应用与BCNU的单独应用对C6大鼠肿瘤模型的作用有明显差别 (P <0 .0 1)。结论 MB对C6细胞具有促凋亡作用 ;MB可能通过bax/bcl xl途径诱导C6细胞凋亡 ;MB与BCNU具有协同的抗胶质细胞瘤作用。

甲异靛联合imatinib对CML K562细胞的促凋亡作用

目的研究甲异靛联合imatinib促进K562细胞凋亡的作用。方法K562细胞经imatinib或/和甲异靛处理48h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡相关指标(线粒体跨膜电位和AnnexinV/PI)的改变,ELISA方法检测caspase3活性改变,Westernblot检测凋亡相关蛋白(cytC,cIAP1,procaspase3和PARP)的改变。结果与单用组相比,20μmol/L甲异靛与0.3μmol/Limatinib联合应用后,线粒体跨膜电位下降细胞比例明显升高,cytC释放入胞浆,caspase3酶原形式procaspase3减少,caspase3活性升高,其底物PARP被降解,AnnexinV水平升高。结论甲异靛与imatinib合用可协同促进K562细胞凋亡。

曲妥珠单抗对不同pH培养HER2阳性乳腺癌细胞增殖的抑制及促凋亡作用

肿瘤细胞外酸性微环境是肿瘤形成和进展的关键环节，亦是导致肿瘤细胞对放疗和化疗药物不敏感的原因之一。乳腺癌除了手术和放疗外，化学药物治疗也是临床重要手段（根据细胞膜靶蛋白的表达特点制定相应的治疗措施）。但由于肿瘤细胞内外环境，尤其是酸性环境导致的分子功能的变异，使得药物治疗效果并不理想，复发率较高。因此，寻找药物治疗的适宜pH环境成为当务之急。

线粒体融合蛋白基因对人成骨肉瘤MG-63细胞的促凋亡作用研究

骨肉瘤（osteosarcoma）是起源于间叶组织最常见的恶性肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,易于复发和肺部转移,预后差[1].骨肉瘤的治疗以扩大或根治性截肢术,辅以化疗的综合治疗为主要治疗方法,但由于骨肉瘤的多重耐药性制约了它的化疗效果和远期预后[2].因此有必要寻找新的治疗方法.

细胞色素C对HL-60细胞促凋亡作用及其与相关凋亡基因的研究

目的 探讨细胞色素C在体外作用于HL - 6 0细胞时细胞发生效应及其相关凋亡基因的表达变化的机制。方法 用不同浓度的细胞色素C作用于HL - 6 0细胞 2 4小时 ,然后应用光镜、荧光显微镜检测HL - 6 0细胞形态的变化 ;用流式细胞仪、DNA凝胶电泳对HL - 6 0细胞凋亡进行检测 ;用RT -PCR检测Bcl- 2、Fas基因表达的变化。结果 当细胞色素C浓度在 0～ 37.5mg L作用HL - 6 0细胞 2 4小时 ,细胞发生的凋亡逐渐增加 ,可见典型的凋亡细胞和明显的DNA梯度 ;同时 ,在该浓度范围内 ,Bcl- 2表达逐渐减少 ,而Fas表达逐渐增加 ;当细胞色素C浓度大于 37 5mg L时 ,细胞凋亡率并不增加 ,而是下降 ,且出现细胞坏死。结论 一定浓度细胞色素C能诱导HL - 6 0细胞发生凋亡 ,并且细胞凋亡率、Bcl- 2、FAS基因表达的变化与细胞色素C浓度呈一定的量效依赖关系 ,细胞色素C诱导HL - 6 0细胞凋亡可能与抑制Bcl- 2基因的表达和激活Fas基因的表达有一定的关系。

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。

人CD40 ligand基因真核表达质粒的构建及对人肝癌细胞HepG2的促凋亡作用

目的:构建含人CD40ligand(CD40L)基因的真核表达载体,并使之在人肝癌细胞HepG2中表达,研究CD40L稳定表达对HepG2细胞的影响.方法:从人外周血单个核细胞总RNA中经RT-PCR扩增出人CD40L基因,经过酶切连接进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A制备重组质粒.重组质粒经酶切及测序证实人CD40L基因成功克隆进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A,并进一步转入大肠杆菌(E.coliDH5a)大量扩增.实验分4组,A组HepG2细胞转染重组质粒,B组HepG2细胞转染不含CD40LcDNA的空质粒,C组HepG2细胞正常培养,D组HepG2细胞加入G418作为转染对照.RT-PCR及流式细胞术鉴定A,B,C3组细胞表面CD40L和CD40的表达后,A,B,C3组细胞分别设6个复孔培养72h后,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达.结果:测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功.流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7%,CD40表达为15.4%;B和C组细胞表面仅有CD40表达,分别为31.7%和28.5%.A组细胞凋亡率45.0±0.3%,B,C组均未发生明显凋亡(P<0.01).与C组细胞比较,A组细胞周期分布主要阻滞在G1期(90.4±1.3%vs60.6±1.5%,P<0.01),S期(6.32±1.0%vs12.0±0.7%)和G2/M期分布(3.3±0.7%vs27.3±1.2%)均有减少(P<0.01).A组细胞Fas表达率(27.8±1.5%)较B组(3.2±0.8%)和C组(4.2±1.0%)明显上调(P<0.01).结论:我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达,CD40L对于HepG2细胞具有促凋亡的作用,这可能与CD40L-CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调和细胞周期阻滞有关.

益气活血方逆转白血病细胞耐药和促凋亡作用的研究

耐药是白血病化疗失败的主要原因之一。在对耐药机制进行深入研究的同时,更重要的是寻找逆转耐药的途径,从而提高化疗效果。本实验初步研究了自组方剂 A(益气活血方)逆转白血病细胞耐药和促凋亡的作用。材料与方法1 试剂 MTT(Sigma 产品)。三尖杉酯碱(H)为北京协和制药厂产品(批号:970403)。柔红霉素(DNR)为意大利 AR-MITALIA CARLO ERMA LTD 产品。抗 P-170单抗为宝灵曼公司产品。抗 BCL-2单抗为美国 CALBIOCHEM Co 产品。LSABTMPAC 为 DAKO JAPAN Co.LID 产品。

人前列腺凋亡反应因子4对K562细胞的促凋亡作用研究

前列腺凋亡反应因子4（prostate apoptosis response-4，Par-4）是Sells等于1994年从前列腺肿瘤细胞中分离出来的一种促凋亡基因。国外学者发现Par-4能增强细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导剂（TRAIL）的敏感性，诱导细胞凋亡，提示Par-4在诱导白血病细胞凋亡中发挥重要作用。

抗人NRP-1单克隆抗体对结肠癌LOVO细胞株的促凋亡作用

目的:研究抗人神经菌毛素1(neuropilin1,NRP-1)单克隆抗体对结肠癌LOVO细胞的促凋亡作用。方法:小鼠腹水法制备抗NRP-1单克隆抗体(NRP-1 MAb)并用rProtein A亲和柱纯化,间接ELISA检测抗体的滴度水平。细胞免疫荧光检测NRP-1蛋白在结肠癌细胞株LOVO上的表达,MTT法检测NRP-1 MAb对LOVO的生长抑制作用,DAPI荧光显微镜法观察细胞凋亡形态,ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪法检测NRP-1 MAb诱导LOVO细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3蛋白的表达。结果:SDS-PAGE和间接ELISA检测纯化的NRP-1 MAb纯度为95%、效价为2.56×10-5;细胞免疫荧光染色显示NRP-1定位于LOVO细胞膜;MTT法检测和ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪法检测结果显示,NRP-1 MAb对LOVO细胞有生长抑制作用和促凋亡作用;DAPI染色·荧光显微镜观察发现,NRP-1MAb可以诱导LOVO细胞核浓缩与碎裂;Western blotting检测到在NRP-1 MAb作用下,LOVO细胞裂解液cleaved caspase-3条带信号增强、caspase-3条带信号减弱。结论:纯化的NRP1 MAb能抑制LOVO细胞的生长并诱导其凋亡。

重构型人caspase-7基因对肿瘤细胞的促凋亡作用

目的观察重构型caspase-7的表达对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。方法用反转录PCR方法获取野生型人caspase-7基因,用重组PCR构建了两种重构型caspase-7基因,即大、小亚基序列次序颠倒的rev-ca2spase-7以及N-端带有绿脓杆菌外毒素转膜结构域部分肽段的融合蛋白(PEⅡ=rev-caspase-7)的基因。将两种重构型caspase-7基因克隆入表达载体pIRES2-EGFP,脂质体法转染肿瘤细胞,通过荧光显微镜观察、电镜观察、MTT检测等方法检测重组基因的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性。结果 成功获得了caspase-7基因,构建了rev-caspase-7基因和rev-caspase-7与绿脓杆菌外毒素(PE)转膜肽段的融合蛋白(PEⅡ-rev-caspase-7)基因及其表达载体。将两种重构型caspase-7转染肿瘤细胞后,证实细胞发生凋亡。结论两种重构型caspase-7均可以有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡。

大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及其与c—jun氨基端激酶信号通路的关系

周颉等研究表明，大黄素对体外培养的乳腺癌细胞株的多药耐药有明显的逆转作用。在肿瘤的发生与发展中．c-jun氨基端激酶（JNK）依赖性的凋亡可能受到抑制，提示JNK信号途径成分是潜在的抑癌基因。本研究旨在探讨大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7促凋亡作用及其与JNK信号通路的关系。

钙蛋白酶小亚基1在细胞凋亡、细胞周期及肿瘤中作用机制的研究进展

钙蛋白酶（calpain）是一种存在于动物细胞中的钙离子依赖性的中性半胱氨酸蛋白酶。钙蛋白酶小亚基1（calpain-s1,capn4）作为calpain的调节小亚基,对细胞周期、细胞凋亡及肿瘤的发生、发展等具有一定的影响。本文就近年来有关capn4在细胞周期、细胞凋亡及肿瘤中的作用机制作一综述。