结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达

目的:研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长.方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出Rv2450c基因,克隆入pSP73载体,测序分析.将该目的基因亚克隆入pGEX4T2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),30℃用IPTG诱导5h然后进行SDSPAGE分析.结果:测序结果证实获得了Rv2450c基因,其序列与GenBank中报道完全一致.SDSPAGE分析表明,Rv2450c基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%.结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达.

藤黄微球菌RPF基因蛋白的克隆、表达与鉴定

目的构建表达藤黄微球菌RPF基因蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达获得基因重组蛋白。方法提取藤黄微球菌基因组DNA,以PCR扩增RPF基因,克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),在30℃用IPTG诱导3 h后进行SDS-PAGE分析。结果测序结果证实获得了藤黄微球菌RPF基因,其序列与GenBank中报道完全一致;SDS-PAGE分析表明,RPF基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的33.8%。结论成功克隆了藤黄微球菌RPF基因,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性及其功能奠定基础。

重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白的纯化及其生物学功能的初步研究

目的:纯化重组的结核分枝杆菌促进复活因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)Rv2389c蛋白,并研究其对结核分枝杆菌、卡介苗(BCG)和藤黄微球菌的生长有无促进作用。方法:用亲和层析柱纯化重组的结核分枝杆菌Rv2389c蛋白,并将其加到一定浊度的结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌培养液中,每隔一定时间测定菌液OD600值。结果:经过纯化,得到了去掉谷胱苷肽转移酶(GST)标签的重组Rv2389c蛋白,浓度为306.9μg/ml,且发现Rv2389c蛋白对结核分杆菌、BCG和藤黄微球菌的生长都有一定的促进作用。结论:成功纯化了重组结核分枝杆菌Rv2389c蛋白,并证实它具有生物学活性,能促进结核分枝杆菌、BCG和藤黄微球菌的生长,为进一步研究其机制奠定了基础。

复合菌群产絮凝剂MAC37的特征及其在黏合剂废水中的应用

以利用复活促进因子(Rpf)从土壤和污水处理系统中分离得到的菌种作为筛选絮凝剂产生菌的菌源,采用高岭土悬浊液为活性评价体系,筛选出4株絮凝率高于50%的菌株.经两两菌株复配,构建出产高效絮凝剂的复合菌群M3+M7,该菌群经优化培养后,絮凝率达96.27%.将其产生的絮凝剂进行提纯固化得絮凝剂粗品MAC37,对其主要成分进行定性和定量分析,并将复合菌群的发酵液应用于黏合剂废水的处理.结果表明:MAC37的主要成分为多糖和蛋白质,含量分别为74.5%和20.4%;黏合剂废水经复合菌群发酵液絮凝处理后,浊度、色度及CODCr的去除率分别为92.57%、94.73%和92.12%.

产絮凝剂复合菌群的培养基及培养条件优化

以利用复活促进因子(Rpf)从土壤和污水处理系统中分离得到的菌种作为筛选絮凝剂产生菌的菌源,构建出产絮凝剂的复合菌群M3和M7.通过单因素实验,以絮凝率(FE)和菌体生长(OD660)为评价指标,对培养基的组成及培养条件进行优化研究.结果表明:该复合菌群M3和M7在组分为淀粉1.5%,(NH4)2SO40.3%,FeCl20.1%,pH 7.0的发酵培养基上,经预发酵,以复配比(M3∶M7)为0.6∶0.4,6%(V/V)的总接种量,28℃,160r/min发酵培养72h后,其产生的高效絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率达96.27%.

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的表达纯化藤黄微球菌（Micrococcus luteus）复活促进因子（Rpf）及结构域（domain）蛋白，研究其对结核分枝杆菌生长的影响。方法诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT—Rpf和pPro—EXHT-Rpf domain，在变性条件下对目的蛋白进行纯化。用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长。结果获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95％和93％，相对分子质量（Mr）大小分别为30×10^3和12×10^3，蛋白质含量分别为471mg／L和337ms／L。Western blot证实，获得的蛋白为我们所需要的目的蛋白。所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长，而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长。结论表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长，而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性。