从NF-κB/Bcl-2信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡角度探讨中医药抑制类风湿关节炎滑膜炎症机制的研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫性疾病,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗凋亡是导致该病病情发展的主要因素。如何促进FLS凋亡并抑制炎症反应是目前RA治疗和研究的重点。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)/B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信号通路在RA发病过程中发挥了关键作用,其与FLS炎症倾向、抗凋亡等密切相关。研究并探讨NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡的机制及作用,介绍中医药靶向该通路促进FLS凋亡进而抑制RA滑膜炎症的研究现状,旨在为中医药治疗RA的研究提供一定基础。

独活寄生汤对TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡和炎症的影响

目的探究独活寄生汤含药血清对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖、凋亡和炎症的影响及作用机制。方法将MH7A细胞分为正常组(10%空白血清)、模型组(10μg·L^(-1) TNF-α+10%空白血清)、独活寄生汤低(10μg·L^(-1) TNF-α+2.5%含药血清+7.5%空白血清)、中(10μg·L^(-1) TNF-α+5%含药血清+5%空白血清)、高(10μg·L^(-1) TNF-α+10%含药血清)剂量组共5组;MTT法筛选独活寄生汤含药血清给药浓度;EdU染色检测细胞增殖情况;免疫荧光染色检测增殖标志物Ki67表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的含量;RT-qPCR和Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路mRNA和蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组细胞增殖水平明显上升,凋亡水平明显减弱,IFN-γ和IL-6的含量升高,IL-4和IL-10的含量减少,TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活;经独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组干预后,均能有效改善细胞异常增殖情况,增强细胞凋亡,抑制炎性反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。结论独活寄生汤含药血清能够抑制TNF-α诱导的RA-FLS异常增殖和促炎因子的分泌,增强细胞凋亡和抗炎水平,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

siRNA沉默锌指蛋白A20基因促进人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞焦亡

目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默锌指蛋白A20基因对人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-RA)焦亡的调节作用。方法培养人HFLS-RA细胞系(MH7A细胞),通过RNA干扰技术靶向敲降人类A20基因,合成siRNA-A20,用脂质体法将siRNA-A20(沉默组)和siRNA-NC(阴性对照组)转染MH7A细胞。RT-qPCR检测细胞中NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达;Western blot法检测细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表达;ELISA法检测细胞培养液中IL-1β和IL-18的水平;透射电子显微镜(TEM)检测细胞焦亡。结果siRNA-A20组MH7A细胞中NLRP3和Caspase-1 mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均显著增高(P<0.01);siRNA-A20组细胞培养上清液中IL-1β、IL-18浓度与对照组相比均显著增高(P<0.01)。与对照组相比,siRNA-A20组部分细胞肿胀和破裂,细胞膜的完整性也丧失,细胞内出现大面积水肿区,细胞核局部核膜凹陷模糊,异染色质固缩增加,分布不均匀并在核膜周围聚集。结论通过siRNA沉默A20表达后可促进HFLS-RA中NLRP3/Caspase-1介导细胞焦亡,为探讨RA临床治疗新方案提供了实验依据。

人参皂苷CK对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞凋亡/自噬的调控作用

目的基于PKM2/mTOR信号通路探讨人参皂苷CK(ginsenoside compound K,CK)对大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡/自噬的调控作用和机制。方法将SD大鼠分为正常组(n=10)、模型组(n=10),CK组(n=10)和甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组(n=10)。大鼠右后足跖皮内注射10 mg/mL弗氏完全佐剂(complete Freund adjuvant,CFA)0.1 mL,制备大鼠AA模型。注射免疫后第15天开始,CK组每天灌胃给药80 mg/kg CK,连续18 d;MTX组每天灌胃给药0.5 mg/kg MTX,每3 d给药一次。每3 d记录大鼠体质量,全身关节炎评分,关节炎指数和足爪肿胀度;计算脾脏和胸腺指数;Western blot检测FLS凋亡和自噬相关蛋白及PKM2和mTOR通路相关蛋白的表达;过表达质粒试剂盒检测FLS自噬流;流式细胞术检测FLS凋亡。结果与AA组比较,CK组和MTX组全身炎症评分、关节炎指数、足爪肿胀度和脾脏指数明显降低(P<0.05),Bax、p62和p-mTOR/mTOR的蛋白水平显著上调(P<0.05),Beclin1、Bcl-2和PKM2的蛋白水平显著下调(P<0.05),FLS凋亡率升高(P<0.05),自噬小体减少。MTX组和CK组全身炎症评分、关节炎指数、足爪肿胀度和脾脏指数的差异无统计学意义(P>0.05)。结论CK可能通过PKM2/mTOR信号通路调节大鼠FLS凋亡/自噬缓解AA大鼠关节炎症。

白藜芦醇通过抑制自噬相关蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ和beclin-1表达促进H_2O_2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对H_2O_2处理的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)影响及自噬相关蛋白的表达。方法取RA患者血清检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性,CCK-8法观察不同浓度H_2O_2对RA-FLS增殖的影响,TUNEL染色观察不同浓度Res对H_2O_2处理的RA-FLS凋亡的影响,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3 I/II(LC3 I/II)和beclin-1蛋白表达水平。结果 RA患者MDA含量升高,总SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低;5μmol/L H_2O_2能促进RA-FLS增殖,Res能剂量依赖性的促进5μmol/L H_2O_2处理的RA-FLS凋亡,降低LC3 I/II和beclin-1水平。结论 RA患者机体处于氧化应激状态,低浓度H_2O_2能促进RAFLS增殖,Res可抑制RA-FLS增殖和促进凋亡,其机制可能与降低自噬蛋白LC3 I/II、beclin-1表达有关。

芍药苷上调lncRNA MALAT1抑制Wnt1/β-catenin通路促进人类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

目的探讨芍药苷(PAE)对体外培养类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)凋亡的影响及其作用机制。方法体外培养RA-FLS,噻唑蓝(MTT)法检测(20、40、80)μmol/L PAE培养24、48、72 h的细胞生存率,流式细胞术检测细胞凋亡率;合成3条长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1的小干扰RNA(si-MALAT1)片段,脂质体转染48 h后,实时定量PCR检测筛选出敲除效果最佳si-MALAT1。将细胞分对照组、PAE组、si-NC组、si-MALAT1组、PAE联合si-MALAT1组。敲低MALAT1表达后,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时定量PCR检测各组Wnt1、β联蛋白(β-catenin)、胱天蛋白酶3(caspase-3)、caspase-9、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)的mRNA表达;Western blot法检测各组Wnt1、β-catenin、caspase-3、caspase-9、Bcl2、BAX的蛋白表达。结果不同浓度PAE对RA-FLS均有抑制作用,相同浓度RA-FLS活力呈时间依赖性下降;与FLS对照组相比,RA-FLS组MALAT1表达下调,经PAE处理后细胞凋亡率增加;RA-FLS中si-MALAT1组细胞凋亡率最低,而PAE联合si-MALAT1组显著增高;PAE组较对照组Bcl2、Wnt1、β-catenin的mRNA表达降低,caspase-3、caspase-9、BAX的mRNA表达则升高;si-MALAT1组的Bcl2表达显著增高,PAE联合si-MALAT1组的Bcl2表达则显著下调,BAX、caspase-3、caspase-9表达显著升高。结论PAE通过上调MALAT1抑制Wnt1/β-catenin通路促进RA-FLS凋亡。

新风胶囊含药血清通过调控环状RNA Cbl原癌基因B(circ-CBLB)影响类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡

目的探讨新风胶囊(XFC)含药血清通过调控环状RNA Cbl原癌基因B(circ-CBLB)对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)增殖、凋亡的影响。方法XFC灌胃大鼠,制备含药血清。人RA-FLS来源于RA患者滑膜组织,用100μL的10 ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激RA-FLS建立模型。构建pcDNA3.1-circ-CBLB及阴性对照,分别转染至RA-FLS中。实验分为对照组、TNF-α处理的RA-FLS组、XFC处理的RA-FLS组、pcDNA3.1-circ-CBLB-NC转染的RA-FLS组(过表达空转组)、pcDNA3.1-circ-CBLB转染的RA-FLS组(过表达组)、pcDNA3.1-circ-CBLB联合XFC处理的RA-FLS组(过表达给药组)。采用CCK-8法检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞周期与凋亡,采用实时定量PCR检测circ-CBLB表达水平,采用ELISA检测抗炎因子白细胞介素4(IL-4)、IL-10,促炎因子IL-6、TNF-α水平。结果XFC最佳含药血清量为200 mL/L,处理时间为72 h;与同一时间模型组相比,XFC组、过表达组、过表达给药组的细胞活力均下降。与模型组比较,XFC组、过表达组、过表达给药组circ-CBLB表达水平升高、凋亡率升高,S期和G2期细胞比例增加,IL-4、IL-10含量升高,IL-6、TNF-α含量降低。结论XFC处理上调RA-FLS中circ-CBLB表达,提高抗炎因子的水平,降低促炎因子的水平,抑制RA-FLS的细胞活力,提高其凋亡率,延长细胞周期,抑制RA-FLS增殖并促进其凋亡。

蠲痹强骨方含药血清通过FGFR1信号诱导人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的机制研究

目的基于成纤维细胞生长因子受体1信号通路探讨蠲痹强骨方含药血清对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法以不同浓度的蠲痹强骨方含药血清处理人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLS),通过CCK8法检测细胞增殖情况,筛选蠲痹强骨方抑制增殖的浓度。利用LPS诱导RA-FLS炎症反应,加入蠲痹强骨方含药血清干预,通过流式细胞仪检测蠲痹强骨方对RA-FLS细胞的凋亡情况。RT-PCR检测mRNA相对表达水平;Western blotting检测蛋白相对表达水平。结果通过CCK8实验发现,不同浓度的蠲痹强骨方含药血清48h和72h可以显著抑制RA-FLS细胞的增殖。流式细胞分析显示,在LPS诱导的炎症环境下,蠲痹强骨方含药血清可以促进RA-FLS细胞的早期和晚期凋亡。RT-PCR结果显示,蠲痹强骨方可以下调LPS诱导下RA-FLS细胞中抗凋亡基因AKT和Bcl-2的mRNA表达。Western blot结果表明,蠲痹强骨方可以抑制LPS诱导下RA-FLS细胞中FGFR1的磷酸化水平和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进促凋亡蛋白BAX的表达。结论蠲痹强骨方含药血清对LPS诱导RA-FLS细胞增殖有显著的抑制作用,并可促使其凋亡,其机制可能与抑制FGFR1信号通路转导有关。

独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

背景:独活寄生汤是治疗类风湿关节炎的经典方剂,但具体作用机制尚不清楚,细胞外囊泡具有细胞间通讯及传递信号的强大功能,可能是该方剂发挥作用的信号载体。目的:探讨独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:肿瘤坏死因子α体外诱导构建类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型,实验分为5组:正常组、模型组、独活寄生汤含药血清组、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡组、生理盐水血清细胞外囊泡组。采用CCK-8法筛选独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳浓度及时间;ELISA检测细胞上清炎症因子水平;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力及迁移能力;Hoechst染色检测细胞凋亡情况;qRT-PCR及Western blot检测细胞凋亡相关基因及蛋白表达。结果与结论:(1)独活寄生汤含药血清作用的最佳体积分数为10%,独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳质量浓度为10 ng/mL,二者作用的最佳时间均为24 h;(2)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均能抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的炎症因子表达(P<0.05)、划痕愈合(P<0.05)、迁移及侵袭(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡的抑制作用更为突出(P<0.05);(3)独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡均可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡;(4)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可增加促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax表达(P<0.05),降低抑凋亡因子Bcl-2表达(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对凋亡相关因子的调节作用更显著。上述实验结果表明独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可以抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的过度增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡。

右美托咪定通过抑制TLR4/NF-κB信号通路促进佐剂性膝骨关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

目的:观察右美托咪定(DEX)对佐剂性膝骨关节炎(KOA)大鼠成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)凋亡的影响,并探讨Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路在其中的作用。方法:SD大鼠右侧前、后膝关节处注射弗氏完全佐剂(FCA)建立KOA模型,建模成功大鼠随机分为模型组、DEX组和DEX+TLR4激活剂组,每组10只,另取10只大鼠设为对照组(将FCA注射液换为生理盐水)。DEX组鞘内注射100μL/kgDEX,DEX+TLR4激活剂组在DEX组基础上鞘内注射500μg/kg脂多糖(LPS),对照组和模型组相同部位注射等体积生理盐水,每天1次,连续28 d。以KOA评估值和膝关节直径评价KOA情况;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠膝关节滑膜组织形态;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TUNEL)染色检测膝关节滑膜组织细胞凋亡情况。各组大鼠FLS分离培养后,CCK-8法检测FLS活力;annexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测FLS凋亡情况;Westernblot法检测FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleavedcaspase-3蛋白水平。结果:建模后,与对照组相比,模型组、DEX组和DEX+TLR4激活剂组KOA评估值和膝关节直径显著升高(P<0.05)。给药后,模型组出现大量炎症细胞浸润现象,纤维组织和滑膜细胞增生明显,呈重度滑膜炎现象;DEX组呈轻度滑膜炎现象;DEX+TLR4激活剂组呈中度滑膜炎现象。与对照组相比,模型组KOA评估值和膝关节直径显著增大(P<0.05);与模型组相比,DEX组KOA评估值和膝关节直径显著减小(P<0.05),膝关节滑膜组织细胞凋亡指数显著升高(P<0.05);与DEX组相比,DEX+TLR4激活剂组KOA评估值和膝关节直径显著增大(P<0.05),膝关节滑膜组织细胞凋亡指数显著降低(P<0.05)。分离培养的细胞均呈纺锤形,血管细胞黏附分子1(VCAM-1)呈阳性表达,即培养细胞为FLS。与对照组相比,模型组FLS活力、FLS中TLR4蛋白水平及核内NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05),核外NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,DEX组FLS活力、FLS中TLR4蛋白水平及核内NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05),FLS凋亡率、cleavedcaspase-3/caspase-3及核外NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05);与DEX组相比,DEX+TLR4激活剂组FLS活力、FLS中TLR4蛋白水平及核内NF-κB p65蛋白水平显著升高(P<0.05),凋亡率、cleavedcaspase-3/caspase-3及核外NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:DEX能够抑制TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达,促进KOA大鼠FLS凋亡,实现对KOA大鼠的保护。

汉黄芩素通过激活活性氧簇介导的p38MAPK信号通路诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的探讨汉黄芩素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)凋亡的影响以及作用机制。方法类风湿关节炎患者关节滑液经原代培养,应用3~5代传代的成纤维样滑膜细胞。按照不同方法处理分为6组:空白对照组、低剂量汉黄芩素组(终浓度为20μg/mL)、中剂量汉黄芩素组(终浓度为50μg/mL)、高剂量汉黄芩素组(终浓度为100μg/mL)、100μg/mL汉黄芩素+NAC组、100μg/mL汉黄芩素+SB203580组。MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),DCFH-DA染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot法检测p38MAPK通路相关蛋白的表达。结果与正常对照组相比,各剂量汉黄芩素均能够抑制RA-FLS细胞的增殖,增加其凋亡,降低MMP以及增加ROS水平,激活p38MAPK信号通路,并且呈现剂量依赖性关系。ROS清除剂NAC和p38抑制剂SB203580可以明显降低汉黄芩素诱导的RA-FLS细胞的凋亡,并且5 mmol/L NAC下调汉黄芩素引起的p38MAPK磷酸化。结论汉黄芩素能够诱导RA-FLS细胞凋亡,ROS/p38MAPK信号通路参与了其凋亡的过程。

5, 7, 3′-三乙酰橙皮素对AA大鼠成纤维样滑膜细胞Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响

目的研究5,7,3'-三乙酰橙皮素(5,7,3'-triacetylhesperetin,TAHP)对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)Jak2/Stat3信号通路及凋亡相关蛋白的影响。方法用弗氏完全佐剂诱导大鼠AA模型;MTT法检测FLS的增殖反应;Hoechst 33258染色法检测FLS的凋亡;RT-PCR法检测FLS中Jak2、Stat3、Bcl-2、Bax及Caspase-3的基因表达;Western blot法检测FLS中p-Stat3及Caspase-3的蛋白表达情况。结果 TAHP呈剂量和时间依赖性抑制FLS的增殖(P<0.05);Hoechst 33258染色结果提示TAHP可以明显地促进FLS的凋亡;同时TAHP(50,250μmol·L-1)可以明显降低Jak2、Stat3及Bcl-2表达,而上调Bax及Caspase-3表达。Western blot结果显示,TAHP可降低p-Stat3的表达、上调Caspase-3表达。结论 TAHP可以抑制FLS增殖,其作用机制可能与抑制FLS Jak2/Stat3信号通路、促进Bax及Caspase-3表达、抑制Bcl-2的表达有关。

海藻多糖对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响及机制研究

目的探讨海藻多糖对体外培养的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synovialcytes,FLS)凋亡的影响及机制。方法采用改良组织块培养法体外培养RA-FLS。分别采用CCK-8比色法、Hoechst 33258染色法、TUNEL染色法及Western blot检测不同浓度海藻多糖(0、15、20、25mg/mL)干预不同时间(0、3、4、5天)后对RA-FLS增殖、凋亡及Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果与0mg/mL海藻多糖组同期比较,15、20、25mg/mL浓度组干预3、4、5天后均可抑制RA-FLS增殖,促进其凋亡(P<0·01),且具有时间和剂量依赖性;15、20、25mg/mL海藻多糖干预4天可上调RA-FLSBax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,促进Caspase-3活化裂解(P<0·05,P<0·01),且呈剂量依赖性。结论海藻多糖在体外呈剂量和时间依赖性抑制RA-FLS增殖,诱导其凋亡,其凋亡机制可能是通过上调细胞内Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白表达影响线粒体通路,从而促进Caspase-3活化裂解,导致RA-FLS凋亡。

丹参诱导类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡

目的探讨丹参对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡的影响。方法类风湿关节炎患者关节滑液经原代培养,应用3～5代传代的成纤维样滑膜细胞,分为3组,分别为高剂量丹参组(丹参终浓度为50 mg/mL)、低剂量丹参组(丹参终浓度为0.39 mg/mL)和溶剂对照组,采用流式细胞术结合Annexin V/FITC和PI双标记染色检测细胞凋亡率。结果与对照组比较,高剂量丹参组和低剂量丹参组细胞凋亡率均较对照组明显增加(P<0.05),并且高剂量丹参组细胞凋亡率明显大于低剂量丹参组(P<0.05)。结论丹参能有效诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡。

白藜芦醇对AA大鼠关节成纤维样滑膜细胞凋亡诱导作用及可能机制

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对低浓度H2O2处理的大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)成纤维样滑膜细胞(FLS)影响,及与线粒体氧化应激蛋白去乙酰化酶3(sirtuins 3,SIRT3)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的关系。方法20只SD大鼠,随机分为正常组、模型组,模型组足趾皮下注射弗氏完全佐剂,造模后d 28处死大鼠,检测大鼠血清氧化应激指标;免疫组织化学染色检测SIRT3、MnSOD在膝关节滑膜组织中的表达;CCK-8法观察不同浓度的H2O2,以及Res处理对FLS的增殖影响;Hoechst 33258和Western blot检测Res对低浓度H2O2处理FLS的凋亡和SIRT3、MnSOD蛋白表达的影响。结果与正常组大鼠比较,AA大鼠血清呈氧化应激状态,滑膜组织中SIRT3、MnSOD表达增加;低浓度H2O2可促进FLS增殖,Res能剂量依赖性抑制低浓度H2O2处理的增殖,增加FLS凋亡;且随着Res的剂量增加,FLS中SIRT3、MnSOD蛋白表达降低。结论低浓度H2O2可促进AA大鼠FLS生长,Res处理可抑制FLS增殖,促进FLS的凋亡,机制可能与Res抗氧化应激作用有关。

PDCD5在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡中表达上调

为了研究程序化细胞死亡因子5(PDCD5)在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡中的作用,在不同的时间加入有效剂量100nmol/L雷公藤内醇酯(triptolide)后,采用实时定量PCR、RT-PCR、Western印迹和直接免疫荧光染色方法检测体外分离培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中PDCD5在mRNA和蛋白水平的表达及蛋白表达特征.在雷公藤内醇酯诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的过程中,PDCD5 mRNA表达水平明显地渐次增加,呈现一种明确的时间依赖性递增表达模式,而PDCD5蛋白有时间依赖性表达上调持续16h,并维持在相对恒定水平.直接免疫荧光染色结果显示,在正常体外培养的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中,PDCD5蛋白的表达较弱,且主要分布在细胞浆.经雷公藤内醇酯处理4 h后,大多数细胞有PDCD5蛋白的聚集,直至12h,细胞核周围PDCD5蛋白聚集显著增强.36h后,PDCD5蛋白以核固缩的形式存在于凋亡的RA FLS中,细胞核染色质明显浓缩,片段化并出现了凋亡小体.上述结果表明,在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的过程中,PDCD5表达上调并在凋亡早期出现核转位,PDCD5蛋白核转位要早于凋亡小体形成.PDCD5蛋白核转位是类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的早期事件,PDCD5不仅参与了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的凋亡过程,而且在类风湿关节炎滑膜增生的凋亡调节中起到重要调节作用.

青藤碱通过miR-23b-3p/FGF9诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

目的:研究青藤碱(SIN)对人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)凋亡的影响及分子机制。方法:分离培养人RA FLS,用100 mg/L的脂多糖(LPS)处理记为LPS组;3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理细胞,记为LPS+SIN组;不作任何处理的细胞作为空白(blank)组。将miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-成纤维细胞生长因子9(FGF9)转染至RA FLS中再用100 mg/L LPS处理,分别记为LPS+miR-con组、LPS+miR-23b-3p组、LPS+si-con组和LPS+si-FGF9组;将anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和pcDNA-FGF9转染至RA FLS中,再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理,分别记为LPS+SIN+anti-miR-con组、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p组、LPS+SIN+pcDNA组和LPS+SIN+pcDNA-FGF9组。CCK-8法检测细胞活力;集落形成实验检测细胞的集落形成数;West⁃ern blot法检测FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p和FGF9的靶向关系。结果:SIN促进LPS诱导的RA FLS凋亡,抑制细胞增殖,上调miR-23b-3p表达,下调FGF9表达。miR-23b-3p靶向调控FGF9,过表达miR-23b-3p或沉默FGF9抑制LPS诱导的RA FLS增殖并促进细胞凋亡。干扰miR-23b-3p或过表达FGF9逆转了SIN对LPS诱导的RA FLS增殖和凋亡的影响。结论:青藤碱可通过miR-23b-3p/FGF9轴诱导RA FLS凋亡,抑制细胞增殖。

蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度优选及其对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

目的:优选蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度,并研究其对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响。方法:采用柱前衍生化反相高效液相色谱法,以煎煮1次后4种主要氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸和甘氨酸)的总煎出量为指标,对蕲蛇饮片及过1~8号筛部分进行筛选,优选蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度。将人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞分为阴性对照组、阳性对照组(1μmol/L甲氨蝶呤)和最佳粉碎粒度蕲蛇煮散剂组(2.0 mg/mL),分别作用48 h后,采用流式细胞术测定细胞凋亡率。结果:蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度为过6号筛,此时4种主要氨基酸总煎出量为(61.27±0.02)mg/g(n=3)。与阴性对照组比较,最佳粉碎粒度蕲蛇煮散剂组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),且略高于阳性对照组。结论:蕲蛇煮散剂的最佳粉碎粒度为过6号筛;蕲蛇煮散剂具有诱导人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的作用。

miR-26a-5p通过JAK2/STAT3信号通路对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-26a-5p对人类风湿关节炎(RA)-成纤维样滑膜细胞(FLSs)凋亡及炎性因子分泌的影响,阐明其作用机制。方法:分离RA患者的膝关节滑膜组织RA-FLSs,将miR-26a-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及阴性对照转染RA-FLSs,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,AnnexinⅤ-FITC/PI与Hoechst 33342染色检测各组细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)与酪氨酸激酶2 (JAK2)/信号传导及转录活化因子3 (STAT3)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与空白对照组和NC-mimic组比较,miR-26a-5p mimic组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平升高(P<0.05),RA-FLSs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中Bcl-2、 JAK2、 p-JAK2、 STAT3和p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平升高(P<0.05);与空白对照组和NC-inhibitor组比较,miR-26a-5p inhibitor组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平降低(P<0.05), RA-FLSs细胞增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05), Bcl-2、 JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05), Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:过表达miR-26a-5p能够抑制RA-FLSs细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。

昆母汤醇提液对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡及caspase-3表达的影响

目的观察昆母汤醇提液对人类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)凋亡及对caspase-3表达的影响,探讨昆母汤治疗RA的部分作用机制。方法滑膜组织取自行关节置换术或关节镜检查术的8例活动性RA患者,分离出FLS进行原代培养,采用流式细胞仪检测法检测昆母汤醇提液对RA-FLS细胞凋亡率的影响,采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液caspase-3蛋白含量的变化。结果昆母汤醇提液和甲氨蝶呤均可显著促进RA-FLS的凋亡,且昆母汤醇提液促RA-FLS凋亡能力在一定程度上呈剂量依赖性。高剂量昆母汤醇提液可使TNF-α诱导的caspase-3表达量增加。结论昆母汤可能通过促进caspase-3的表达来促进RAFLS凋亡,具有治疗RA的潜在价值。