黑皮质素受体基因多态性与婴儿痉挛症及促肾上腺皮质激素反应性的相关性研究

目的探讨黑皮质素受体(MC2R～MC4R)基因变异及单核苷酸多态性与婴儿痉挛症发病及促肾上腺皮质激素治疗反应性的关系,并对研究中发现的最具意义的单核苷酸多态性进行深入的功能学研究。方法采用DNA直接测序法检测MC2R～MC4R基因编码区及启动子区基因突变及多态性;SHEsis和Haploview3.32程序构建单体型,分析不同多态性基因型、等位基因及所构建单体型在婴儿痉挛症患儿和正常对照受试儿童中的分布频率,并观察其与促肾上腺皮质激素治疗反应的相关性。结果测序显示,MC2R基因启动子区共存在4个单核苷酸多态性位点,其中-2T>C为新发现位点,3个单核苷酸多态性位点(rs1893220、rs2186944和-2T>C)组间分布频率差异具有统计学意义(P=0.04,0.02,0.01)。常见单体型TCCT对婴儿痉挛症的发生具有保护作用(P=0.00),且TCCT携带者比非携带者对促肾上腺皮质激素治疗更为敏感(P=0.00)。体外功能学研究证实,MC2R基因TCCT型启动子转录效率是TCCC的4倍(P=0.00),经促肾上腺皮质激素刺激后含TCCT单体型启动子MC2R mRNA表达水平上调5倍(P=0.00),而含TCCC单体型启动子仅上调1.50倍(P>0.05)。MC4R基因启动子区单核苷酸多态性位点rs11872992与婴儿痉挛症的发生有关,婴儿痉挛症组患儿TC型频率低于正常对照组(P=0.00);T型等位基因携带者对促肾上腺皮质激素治疗效果优于非T型等位基因携带者(P=0.01)。但MC3R单核苷酸多态性组间分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论黑皮质素受体单核苷酸多态性与婴儿痉挛症的发生有一定关系,并可影响促肾上腺皮质激素治疗的反应性。这一发现有助于理解婴儿痉挛症的发病机制,并为临床早期预测促肾上腺皮质激素治疗反应提供一定线索。

金华猪促黑激素皮质素受体4基因多态性分析

应用PCR-RFLP方法对金华猪Ⅰ系(154头)、金华猪Ⅱ系(41头)和金华猪Ⅲ系(53头)的MC4R基因的1269～1494bp区段进行扩增,并用TaqI酶进行酶切,比较了MC4R酶切后基因型频率分布情况。结果表明,AA基因型频率在金华猪上较高达到0.9194,在Ⅱ系中最高达到0.9512,Ⅲ系次之达到0.9434,Ⅰ系最低达到0.9026,而金华猪的AB基因型和BB基因型频率都较低分别为0.0565和0.0242。

α-促黑激素类似物与黑素皮质素受体3和4亲和活性的筛选

目的:筛选具有中枢黑素皮质素受体3和4(melanocortin 3 and 4 receptors,MC3R,MC4R)高亲和活性和选择性的新化合物(α-促黑激素类似物)。方法:从大鼠下丘脑及周围组织中提取富含MC3R和MC4R的膜蛋白,进行放射标记的α-促黑激素([125I]-NDP-α-MSH)配体与MC3R,MC4R的结合实验,求出受体最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。用10 nmol.L-1浓度的与MC3R和MC4R高亲和活性的已知激动剂(PT141)和已知阻滞剂(SHU9119)及各受筛化合物进行竞争结合或抑制实验,比较并找出与MC3R和MC4R具有高亲和活性的新化合物。结果:饱和实验求出Bmax=64.81 pmol.g-1蛋白,Kd=0.768 2 nmol.L-1。受筛化合物中LK-FS024与MC3R和MC4R的亲和活性最高,与PT141几乎相同(相对结合率为97%)。结论:LK-FS024与MC3R和MC4R有较高亲和活性,可能是一个具有较好药理研究价值的α-MSH类似药。

促黑皮质素与人类肥胖的关系研究进展

近年来肥胖症的发病率呈增高的趋势 ,已成为糖尿病、心脑血管病等一系列疾病的重要危险因素。从近年来对肥胖的研究发现促黑皮质素系统是维持人体体重平衡的重要系统之一。本文就近年来有关该系统在肥胖的发生、病因机制方面的研究进展作一综述。

促黑激素皮质素对能量代谢以及黑色素沉积的影响

促黑激素皮质素(MC)是一类激素的总称,均由共同的前体阿片促黑激素皮质素原(POMC)裂解而来,近年来越来越多的研究表明,中枢黑皮质素系统(CMS)中POMC翻译后的加工产物α-促黑素细胞激素(α-MSH)及其脑内相应受体MCRs是leptin介导能量代谢途径下游的重要中介物。主要就α-MSH及其相应受体MCRs对能量代谢以及黑色素沉积的影响作一综述。

黑皮质素系统对骨代谢影响的研究进展

骨质疏松(osteoporosis,OP)是由于破骨细胞的骨吸作用收与成骨细胞的骨形成作用所形成的骨重建过程失衡所致。黑皮质素系统由促黑素(melanocyte-stimulating hormone,MSH)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、黑皮质素受体(melanocortin receptor,MCR)、内源性黑皮质素拮抗剂及2种辅助蛋白组成。近年来,促黑素与骨代谢相关性研究逐渐受到重视,文中就黑皮质素系统对骨代谢的影响作一综述。

α-黑素细胞刺激素及黑皮质素受体-4在能量平衡和繁殖中的功能研究

阿片黑素促皮质激素原(POMC)是黑皮质激素的前体物质,在机体中广泛分布。近年来,POMC及其衍生物黑素细胞刺激素(MSH)和黑皮质素受体-4(MC4R)在能量稳态和繁殖活动中的作用备受关注。研究发现,POMC神经元及其加工后的产物对摄食和体重的调节具有重要作用。此外,POMC神经元在下丘脑中与GnRH神经元紧密接触,由其产生的神经递质和神经肽可能对GnRH神经元具有重要的输入作用,从而直接或间接地调控下丘脑–垂体–性腺轴(HPG)中繁殖相关激素的合成并影响生殖活动。本文综述了黑皮质素系统对能量稳态和繁殖活动的调控作用以及目前MC4R在硬骨鱼类中的药理学研究,以期其能够在动物的生长发育和繁殖中具有应用前景。

MC5R在促黑素对骨骼肌细胞脂肪酸氧化影响中的作用

目的观察黑皮质素受体(MCR)种类在促黑素(α-MSH)对小鼠骨骼肌细胞脂肪酸氧化影响中的作用。方法α-MSH、(Glu6)α-MSH、SHU9119、α-MSH+SHU9119处理体外培养的原代骨骼肌细胞和C2C12成肌细胞后测定脂肪酸氧化。siRNA方法抑制C2C12成肌细胞MC5R后观察α-MSH、SHU9119对脂肪酸氧化的影响。结果α-MSH在骨骼肌细胞及C2C12成肌细胞中剂量依赖性地增加了脂肪酸氧化,SHU9119和α-MSH+SHU9119处理组也显著增加了脂肪酸氧化,但(Glu6)α-MSH处理组对脂肪酸氧化无统计学意义。siRNA方法抑制MC5R,显著降低了α-MSH和SHU9119促进脂肪酸氧化的作用。结论α-MSH通过MC5R促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化。

针刺对肥胖大鼠MSH及POMC影响的实验研究

目的:观察针刺对肥胖大鼠促黑皮质素(MSH)及前阿片黑素促皮质激素原(POMC)的影响。方法:选用刚断乳健康SD雄性大鼠,分为正常组和造模组,采用自制高脂饲料制备肥胖大鼠模型,随机分为模型组及针刺组,针刺组针刺梁门、天枢、大横、内庭穴,连续治疗2周。观察各组大鼠MSH及POMC的变化。结果:针刺后针刺组大鼠体重下降,与模型组比较,差异有非常显著性意义(P<0.01)。针刺组MSH、POMC水平明显低于模型组(P<0.05);针刺后针刺组MSH、POMC与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:针刺在改善肥胖大鼠体重的同时可调节肥胖大鼠MSH及POMC的水平。

中枢黑皮素系统与肥胖

中枢黑皮素系统在摄食行为及能量代谢的调节中起着重要的作用。瘦素作用于下丘脑阿片促黑激素皮质素原 (POMC)神经元 ,促进POMC生成α 促黑激素 (α MSH) ,后者作用于黑皮素受体 4 (MC4R)起抑制食欲的作用。目前发现数种人类单基因突变肥胖病与MC4R基因 ,POMC基因及 POMC翻译后加工所需酶PC 1基因突变有关。

黑皮质素受体在破骨细胞形成中的作用

目的观察由Raw264.7细胞诱导破骨细胞形成过程中黑皮质素受体(MCR)的作用。方法用α-促黑素(α-MSH)及其类似物SHU9119、PT141、THIQ分别处理体外培养的Raw 264.7细胞,并依此分为对照组、α-MSH组、SHU9119组、PT141组、THIQ组和α-MSH加SHU9119组。培养6天后,经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后,观察并计数各组破骨细胞形成数目。RT-PCR法测定Raw 264.7细胞表达的MCR种类。结果在Raw 264.7细胞诱导破骨细胞过程中,α-MSH呈剂量依赖性的增加了破骨细胞形成。SHU9119组、PT141组及α-MSH加SHU9119组均显著增加了破骨细胞形成数目(P<0.05);但THIQ处理组对破骨细胞形成无统计学意义(P>0.05)。Raw 264.7细胞表达5种MCR。结论 MCR激动剂能显著增加破骨细胞形成数目,可能主要通过结合MCR1和/或MCR5促进破骨细胞形成。

长短日照下绍鸭性成熟时间,下丘脑GnRH-I、POMC和NPY mRNA表达的差异

利用长日照和短日照环境调控绍鸭的性成熟时间,并采用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法, 检测两种日照组(n=6)鸭性成熟过程中下丘脑促性腺激素释放激素-Ⅰ(GnRH-Ⅰ)、阿片促黑激素皮质素 原(POMC)和神经肽Y(NPY)mRNA表达的发育性变化及日龄间差异。结果表明,长日照组性成熟时间较短 日照组提前30d。RT-PCR结果显示,两组鸭下丘脑GnRH-Ⅰ mRNA的发育性表达模式相似,从出雏至性成熟 过程中,其表达水平呈逐渐增加趋势;长日照组下丘脑GnRH-Ⅰ mRNA表达丰度均高于同日龄短日照组,并于 120日龄时其差异达显著水平。两组POMC mRNA的表达丰度呈现先增加后降低趋势,于性成熟前后显著下降; 日照长度对其基因表达具有显著影响。两组NPY mRNA表达水平分别于60和90日龄时显著升高,于性成熟时 显著下降,但光照对其基因表达无显著影响。下丘脑GnRH-Ⅰ基因表达的显著上调可能是禽类性成熟启动的关 键因素,也是长日照条件下绍鸭性早熟的主要原因;GnRH-Ⅰ表达的上调与下丘脑POMC和NPY mRNA表达变 化有关。

孵出至产蛋前绍兴鸭下丘脑GnRH-Ⅰ与POMC mRNA表达的变化

采用反转录多聚酶链式反应 (RT PCR)方法 ,检测绍兴蛋鸭出雏后至性成熟期 (12 0日龄 )下丘脑促性腺激素释放激素 (GnRH Ⅰ )和阿片促黑激素皮质素原 (POMC)mRNA的变化。结果表明 :从 1日龄到 12 0日龄 ,下丘脑GnRH ⅠmRNA水平逐渐升高 ,1日龄水平最低 ,90日龄时显著高于 1日龄 (P <0 0 5 ) ,12 0日龄时极显著高于 1和 30日龄 (P <0 0 1) ,显著高于 6 0日龄 (P <0 0 5 )。下丘脑POMCmRNA含量呈先升后降趋势 ,6 0日龄时表达量最高 ,其水平极显著高于 1,30和 12 0日龄 (P <0 0 1) ,显著高于 90日龄时水平 (P <0 0 5 )。提示POMC基因表达的下调与GnRH Ⅰ基因表达的上调之间可能存在联系 ,两者的协同作用可能是青春期启动的关键因素。

促黑素对小鼠骨骼肌细胞脂肪酸氧化的影响

目的观察α-促黑素(α-MSH)对小鼠骨骼肌细胞脂肪酸氧化的影响及其机制。方法 8周龄C57BL/6J小鼠分成生理盐水对照组和实验组(α-MSH组),两组分别皮下注射生理盐水和α-MSH后0、0.5、1、3、5h测定比目鱼肌的脂肪酸氧化限速酶-肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)活性。体外培养的原代骨骼肌细胞和C2C12细胞,利用RT-PCR法测定黑皮质素受体(MCR)的表达,并α-MSH处理2h后观察脂肪酸氧化。结果α-MSH皮下注射后1、3h时CPT-1活性显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。原代骨骼肌细胞和C2C12细胞中表达MC1R、MC3R、MC4R和MC5R,α-MSH剂量依赖性地促进脂肪酸氧化。结论α-MSH可能通过MCR促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化。

促黑素对小鼠成骨细胞OPG/RANKLmRNA表达的影响

目的探讨原代培养的小鼠成骨细胞黑皮质素受体(MCR)表达的种类及促黑素(α-MSH)对其骨保护素(OPG)和核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。方法酶消化法分离3 d内新生C57BL/6小鼠原代成骨细胞,培养液中分别加入10-7、10-8和10-9mol/L的α-MSH培养12 h,作为A、B、C组;培养液中加入10-7mol/Lα-MSH,分别培养6、12、24 h,作为D、E、F组。对照组正常培养。采用实时定量PCR方法分析α-MSH对成骨细胞OPG/RANKL mRNA表达的影响。利用RT-PCR法测定原代成骨细胞MCR的表达。结果小鼠原代成骨细胞表达MC1R、MC2R、MC4R和MC5R;与对照组相比,α-MSH促进OPG/RANKL mRNA的表达(P<0.05)。结论α-MSH可能通过MCR系统促进小鼠原代成骨细胞OPG/RANKL mRNA的表达。

瘦素经POMC神经元对神经内分泌-生殖轴的影响

目的:探讨瘦素(leptin)对神经内分泌-生殖轴的可能调节机制。方法:建立卵巢摘除补充雌激素(OEP)大鼠模型,动物随机分为leptin组、α-黑素细胞刺激素(α-MSH)组和生理盐水对照组,于侧脑室注射后1h、2h、4h和6h分别取血和脑组织。ELISA法检测血中促性腺释放激素(Gn-RH)、黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)浓度。Western印迹检测下丘脑组织中阿片促黑激素皮质素原(POMC)蛋白量的变化。结果:侧脑室注射leptin可促进GnRH、FSH、LH的分泌,而注射α-MSH则抑制GnRH、FSH和LH的分泌。注射leptin显著增加下丘脑中的POMC含量。结论:Leptin可能通过POMC神经元或与其他途径共同影响下丘脑-垂体生殖轴的分泌功能;POMC神经元发挥的调节作用可能晚于或弱于其它神经元。

中国汉族婴儿痉挛症儿童MC2R基因多态性的分布

目的婴儿痉挛症是婴幼儿期起病的年龄依赖性癫痫性脑病,促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)是治疗婴儿痉挛症的一线用药,对绝大多数患者治疗有效。ACTH受体又称黑皮质素2受体(MC2R),MC2R基因启动子区单核苷酸多态性与婴儿痉挛症的发病及其耐药相关。调查中国汉族婴儿痉挛症儿童MC2R基因多态性的分布情况。方法符合婴儿痉挛症纳入条件的患儿共334例,各采集其静脉血3 ml,对其MC2R非编码区基因进行提取,聚合酶链式反应和一代测序,之后进行数据整理和分析。结果中国汉族婴儿痉挛症儿童MC2R基因启动子区TCCT单体型非携带者(0/0)占总人数的9.9%,杂合携带者(TCCT/0)占60.8%,纯合携带者(TCCT/TCCT)占20.3%。3种MC2R多态性基因型性别分布差异有统计学意义(P<0.05),TCCT/TCCT基因型中男性多,0/0基因型中女性多。结论调查了中国汉族婴儿痉挛症儿童MC2R基因多态性TCCT单体型的分布,对ACTH治疗效果差的TCCT非携带基因(0/0)占总人数少,约占总人群10%。

代谢综合征患者MC4R-rs6567160位点基因多态性变化及其临床意义

目的探讨促黑激素皮质素受体4(MC4R)-rs6567160位点基因多态性在代谢综合征(MS)发生、发展中的作用。方法选取MS患者520例(MS组)、体检健康者704例(对照组),检测两组MC4R-rs6567160位点TT、CC、TC三种基因型分布频率,分析TT、CC、TC三种基因型患者腰围、BMI及血糖、糖化血红蛋白(Hb A1c)水平及MC4R-rs6567160位点基因型与MS的关系。结果 MS组MC4R-rs6567160位点TT基因型分布频率低于对照组,CC基因型分布频率高于对照组,组间比较P均<0. 01。与TT基因型及TC基因型者比较,CC基因型者腰围和BMI明显升高(P均<0. 01);与TT基因型及CC基因型者比较,TC基因型者FPG及Hb A1c明显升高(P均<0. 05)。MC4R-rs6567160位点基因型是MS发病的危险因素(OR=1. 385,95%CI:1. 016~1. 889,P <0. 05),其中TC基因型发生MS的概率是TT基因型的1. 333倍(OR=1. 333,95%CI:1. 037~1. 713,P <0. 05),是CC基因型的2. 661倍(OR=2. 661,95%CI:1. 549~4. 571,P <0. 01)。结论 MC4R-rs6567160位点基因多态性是MS发生的独立危险因素,携带MC4R-rs6567160位点CC基因型的人群更易发生MS。

促黑素对破骨细胞形成的影响

以核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和促黑素（α-MSH）孵育Raw264．7细胞6d，经抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形成的数目．并检测酸性磷酸酶活性。RT-PCR检测Raw264．7细胞5种黑皮质素受体（MCR）的表达。结果显示，与RANKL组相比较，RANKL＋α—MSH组显著增加了破骨细胞的形成数量（P〈0．05），呈剂量依赖性，单独应用α—MSH组未见破骨细胞形成。RANKL组和RANKL＋α-MSH组的酸性磷酸酶活性显著高于对照组和α-MSH组（P〈0．05），但前2组之间差异无统计学意义（P〉0．05）；RT—PCR结果显示Raw264．7细胞5种MCR均表达。结果提示，α-MSH可能通过RANK信号通路促进破骨细胞形成。

促黑素对小鼠血清骨特异性碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原交联C端肽含量的影响

目的观察促黑素对小鼠血清骨特异性碱性磷酸酶(ALP-B)和I型胶原交联C端肽(CTX-I)含量的影响。方法 9周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组和实验组(每组8只),分别皮下注射生理盐水0.2 mL和促黑素100 nmol(加生理盐水0.2 mL),注射1,3,5 d后,摘眼球取血,测定血清ALP-B和CTX-I的含量。体外培养原代成骨细胞,用RT-PCR法测定黑皮质素受体(MCR)的表达。结果皮下注射促黑素3,5 d后,实验组与对照组相比,血清的ALP-B含量显著减少而CTX-I含量显著增加(均P<0.05)。小鼠原代成骨细胞表达MC1R～2R、MC,4R～5R。结论促黑素可能通过MCR作用于成骨细胞和破骨细胞对小鼠血清ALP-B和CTX-I产生影响。