表皮生长因子加强胶质细胞系源性神经营养因子对PD模型大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用

目的：研究表皮生长因子（EGF）能否加强胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）保护帕金森病（PD）模型大鼠黑质内多巴胺（DA）能神经元。方法：大鼠右侧纹状体内注射6羟多巴胺（6-OHDA）并行为学分析筛选PD动物模型。将动物模型随机分为EGF＋GDNF组（右侧黑质内注射EGF＋GDNF）和GDNF组（右侧黑质内注射GDNF）。动物继续存活至第21天，取一部分动物中脑黑质节段，用免疫组织化学显色方法，以抗钙结合蛋白D28K（CB）和胶质源纤维酸性蛋白（GFAP）抗体免疫反应阳性分别检测右侧黑质含CB的神经元及激活的星形胶质细胞，光镜下观察并进行细胞计数；另一部分动物被快速断头取脑，分离右侧黑质，用免疫印迹法分析黑质CB及GFAP蛋白的表达，蛋白条带用图像处理仪扫描，结果用LabWorks软件分析处理。结果：免疫组织化学显色显示，EGF＋GDNF组大鼠黑质内CB及GFAP反应阳性细胞数量均高于GDNF组；免疫印迹法检测表明EGF＋GDNF组大鼠黑质内CB及GFAP蛋白表达量高于GDNF组。结论：EGF可能通过促进PD模型大鼠黑质内神经元表达CB和激活星形胶质细胞，从而加强GDNF对黑质内DA能神经元的保护作用。

纹状体内注射胶质细胞源神经营养因子对帕金森病模型大鼠多巴胺能神经元剂量依赖性的保护

目的:探讨不同剂量胶质细胞源神经营养因子对6-羟多巴制造的偏侧帕金森病大鼠模型黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法:实验于2005-04/10在四川大学华西医学中心组织胚胎学与神经生物学教研室及信号转导与分子靶向治疗研究室完成。选取雄性SD大鼠(鼠龄1.5个月)20只。大鼠前脑内侧束注射6-羟多巴,4周后应用免疫组织化学法检测中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞数量的变化,建立帕金森病大鼠模型;取SD大鼠15只分为3组,分别为对照组、10,100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组,每组5只。右侧前脑内侧束注射5g/L6-羟多巴4mL,制备帕金森病模型,将不同剂量的胶质细胞源性神经营养因子(5g/L或25g/L,用生理盐水溶解)注入同侧的纹状体内,对照组纹状体内用等量生理盐水替代。手术后4周,取实验动物,麻醉,灌注,切片,再行中脑抗酪氨酸羟化酶免疫组织化学反应。镜下细胞计数;应用配对T检验、ANOVA,及SNK法进行统计。结果:所有实验动物生存状况良好,未发生死亡现象,全部进入结果分析。①损伤侧酪氨酸羟化酶阳性神经元形态未见明显的改变,但数量明显减少,明显低于对侧细胞数,差异有显著性[(11.36±3.85),(115.12±17.06),t=3.078,P<0.01]。②损伤侧大多数小胶质细胞胞体变圆增大,突起变短增粗,染色变深。损伤侧明显高于对侧,差异有显著性[(292.20±19.73),(80.40±10.00),t=2.832,P<0.01]。③中脑黑质损伤侧星形胶质细胞数量显著增加,增生的GFAP阳性星形胶质细胞胞体肥大,突起变短、增粗,染色变深。损伤侧显著高于对侧,差异有显著性[(507.64±19.99),(226.88±20.30),t=2.971,P<0.01]。④损伤侧黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞数明显低于对侧,差异有显著性[(10.16±2.90),(116.84±15.92),t=3.975,P<0.01]。10μg胶质细胞源性神经营养因子处理组损伤侧明显高于对侧,差异有显著性[(114.60±18.71),(66.24±17.19),t=3.811,P<0.01];100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组损伤侧明显高于对侧,差异有显著性[(114.88±19.211),(92.72±16.29),t=3.725,P<0.01]。⑤胶质细胞源性神经营养因子处理组存活的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量均明显高于对照组(P<0.01)。100μg胶质细胞源性神经营养因子处理组神经元存活率显著高于10μg胶质细胞源性神经营养因子处理组,差异亦具有显著性(P<0.01)。结论:纹状体内运用胶质细胞源性神经营养因子,对多巴胺能神经元具有明显的保护作用,该作用在10～100μg范围内呈剂量依赖性。

胶质细胞系源性神经营养因子保护帕金森模型大鼠黑质多巴胺能神经元机制的研究

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在保护黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元过程中,钙结合蛋白D28K(calbindin 28K,CB)和星形胶质细胞的可能作用。方法采用大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备帕金森病(Parkinson disease,PD)模型。注射后第7天,根据行为学分析筛选模型鼠,将模型鼠随机分为3组:空白对照组,PBS组(右侧黑质注射PBS)和GDNF组(右侧黑质注射GDNF)。空白对照组动物分别于6-OHDA注射后第7天1、4天2、1天和28天时,PBS组和GDNF组动物分别于6-OHDA注射后第14天、21天和28天时,行黑质节段连续冠状石蜡切片,以酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)、CB和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrous acid protein,GFAP)免疫组织化学染色,分别显示DA能神经元、含CB神经元和星形胶质细胞,光镜观察以及细胞计数,统计学处理。结果①TH免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第28天,GDNF组大鼠右侧黑质TH表达阳性神经元数量显著多于空白对照组和PBS组;②CB免疫组织化学染色结果:6-OHDA注射后第7天,空白对照组大鼠右侧黑质尚可观察到CB表达阳性神经元,之后的时间点空白对照组和PBS组均观察不到,而GDNF组大鼠右册黑质处在所检测的各时间点均可观察到CB表达阳性神经元;③GFAP免疫组织化学染色结果:空白对照组在6-OHDA注射后第7天时有少量的GFAP表达阳性细胞,于注射后第14天时GFAP表达阳性细胞数达高峰,之后逐渐减少,注射后第28天时已基本检测不到;PBS组GFAP表达阳性细胞数量与空白对照组的表现一致,而GDNF组大鼠黑质在所检测的各时间点均可观察到大量反应性增生的星形胶质细胞。结论CB和(或)星形胶质细胞可能参与GDNF保护并促进PD模型大鼠黑质DA能神经元存活的过程。

经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元保护作用的实验研究

目的研究经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GD-NF)对帕金森病(Parkinson disease,PD)模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法利用1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制备成年小鼠PD模型,通过单侧纹状体定位注射GDNF,取中脑黑质节段,做连续冠状石蜡切片,结合免疫组织化学染色方法,观察各组酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、钙结合蛋白(calbindin D28k,CB)的表达,光镜观察并细胞计数,统计学分析。结果在模型制备的第4、6天,单侧纹状体定位注射GDNF后,小鼠黑质致密部TH与CB阳性神经元数量显著多于注射PBS组。结论经纹状体注射GDNF对成年PD小鼠黑质多巴胺能神经元具有保护作用,且这种保护作用可能与细胞内CB表达增加有关。

脑源性神经营养因子介导帕金森病的运动防治:作用与机制

背景:运动干预作为经济有效的非物理疗法,可有效上调脑源性神经营养因子表达进而防治帕金森病发生发展,但目前关于靶向脑源性神经营养因子的运动治疗策略在延缓帕金森病发生发展的潜在作用机制尚不明晰。目的:以脑源性神经营养因子和帕金森病的关系为切入点,分析帕金森病病理状态下运动对脑源性神经营养因子表达的特异性调控作用及机制,梳理脑源性神经营养因子介导下不同运动方式对帕金森病的改善效果,并阐明靶向脑源性神经营养因子的运动治疗策略在防治帕金森病的潜在作用机制,旨在为运动防治帕金森病提供新的理论依据。方法:以“帕金森病,脑源性神经营养因子,神经保护,多巴胺,神经元异常凋亡,神经炎症反应,突触可塑性,运动”等为中文检索词;以“Parkinson’s disease,BDNF,Neuroprotection,neuroinflammation,synaptic plasticity”等为英文检索词,分别检索中国知网、万方数据库、PubMed和Web of Science数据库,搜寻各数据库建库至2024年2月发表的所有研究文献,根据纳排标准共获得核心相关文献98篇。结果与结论:①在帕金森病理背景下,运动可通过促进肌因子鸢尾素大量分泌,并降低色氨酸-犬尿氨酸代谢途径紊乱特异性调控脑源性神经营养因子表达。②有氧运动,尤其是特殊有氧运动(动物:旋转杆步行/人类:北欧健走)以及多模式运动可显著上调脑源性神经营养因子表达,进而改善帕金森病的运动症状,此外脑源性神经营养因子还介导身心运动(太极拳)对帕金森病患者认知障碍和睡眠障碍等非运动症状的有效调节。③运动诱导的高表达脑源性神经营养因子可能通过上调抗炎因子白细胞介素10、神经生长因子β和转化生长因子β表达,下调促炎因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β表达,并抑制核转录因子κB信号通路表达降低小胶质细胞活性减轻神经炎症反应;增加酪氨酸羟化酶活性以促进多巴胺合成释放,并通过下调基质金属蛋白酶3及糖原合成酶激酶3β表达抑制α-突触核蛋白在丝氨酸129位点的磷酸化修饰,以防止神经异常凋亡;诱导突触效能的长时程增强发生,促进突触后致密区蛋白95及突触素大量表达以改善突触可塑性,发挥神经保护作。④鉴于脑源性神经营养因子在帕金森病发病进程及治疗中发挥重要作用,靶向脑源性神经营养因子的运动治疗策略将有助于推动帕金森病疾病“运动+药物”精准医疗的发展。但由于目前研究采用的运动处方较为单一,且研究焦点主要围绕运动症状而缺乏对非运动症状的考察,因此亟待学者采用更加统一和系统的运动处方,围绕非有氧运动类型对同一批帕金森病患者进行长期纵向跟踪研究,以此完善帕金森病运动防治领域研究的不足。

神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子脑内移植对Parkinson病大鼠纹状体内多巴胺含量的影响

将原代培养的胚鼠(E14.5)腹侧中脑神经干细胞(NSCs)单独或联合胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)移植入Parkinson病(PD)大鼠纹状体内,术后各组动物存活一段时间,观察旋转行为后处死,取纹状体组织做高效液相色谱检测多巴胺(DA)含量。探讨NSCs单独或联合GDNF脑内移植对PD大鼠纹状体内DA含量的影响。结果显示:与PD模型相比,NSCs单独或联合GDNF脑内移植均能提高PD大鼠纹状体内的DA含量(P<0.05);在术后30d和60d,DA含量在GDNF+NSCs组的增加幅度比NSCs组更加明显,动物旋转行为亦得到明显改善(P<0.05)。上述结果表明,NSCs单独或联合GDNF移植均对PD大鼠有一定的治疗作用,而NSCs联合GDNF移植的治疗效果更好。

小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验

背景:目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道,且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据。目的:观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用。方法:取Wistar大鼠,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外培养并活化小胶质细胞,酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。实验分为5组:骨髓间充质干细胞组;小胶质细胞组;脂多糖+小胶质细胞组;骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组;分别取各实验组的培养上清,对中脑多巴胺神经元进行培养。单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养。采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响。结果与结论:含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%;小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%;骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%;脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%;而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%,高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P<0.05)。此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降,但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组。提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达,使得多巴胺能神经元免受毒素的损害,抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡。

抗坏血酸联合胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的研究抗坏血酸(AA)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响。方法从新生24h内的SD大鼠脑组织分离和培养神经干细胞,进行神经干细胞鉴定。第二代神经干细胞诱导培养基中分别给予AA或(和)GDNF,10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测。结果各诱导组均检测到THmRNA的表达;与对照组比较,AA及GDNF均能增加NSC向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05);与单独运用100μmol/LAA或10ng/mlGDNF组比较,联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05)。结论AA和GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,两者联合诱导后分化作用得到进一步加强。

胶质细胞源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的修复作用

目的观察向脑室或壳核内直接注射胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对帕金森病大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的修复作用。方法 70只大鼠,于右侧前脑内侧束(MFB)及腹侧被盖区(VTA)分别注射12μg 6-OHDA,观察2周获得39只帕金森病模型大鼠。其中15只大鼠(观察A组)脑室内注射人重组GDNF,14只(观察B组)壳核内注射人重组GDNF,5只(对照A组)脑室内注射赋形剂,5只(对照B组)壳核内注射赋形剂。采用免疫组化和量化形态学分析方法测算酪氨酸羟化酶阳性(TH+)神经元数目、大小及TH+纤维密度。结果对照A、B组大鼠右侧中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目及纹状体内侧部TH+神经纤维密度均较左侧降低,P均<0.05。观察A组与对照A组相比、观察B组与对照B组相比,双侧中脑组织黑质TH+多巴胺能神经元大小和数目及纹状体内侧部TH+神经纤维密度均明显升高,P均<0.05。结论脑室或壳核内直接注射GDNF对帕金森病大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元损伤有修复作用。

大脑多巴胺神经营养因子联合左旋多巴治疗帕金森病的有效性和安全性

目的探讨大脑多巴胺神经营养因子联合左旋多巴治疗帕金森病的有效性与安全性。方法选取武警浙江省总队杭州医院2014年9月~2016年2月收治的100例帕金森病患者,随机分为单一用药组（n=50）和联合用药组（n=50）。单一用药组使用左旋多巴,联合用药组采用大脑多巴胺神经营养因子联合左旋多巴,分别观察治疗6、12、18 w后患者UPDRS I~Ⅲ评分,血清同型半胱氨酸（Hcy-Serum homocysteine）水平变化及不良反应情况。结果联合用药组治疗6、12、18 w后UPDRSⅠ~Ⅲ评分均显著低于治疗前（P〈0.05）,治疗12、18 w后血清同型半胱氨酸水平均显著低于治疗前（P〈0.05）。联合用药组不良反应发生率为24%,低于单一用药组的84%（P〈0.05）。结论大脑多巴胺神经营养因子联合左旋多巴治疗帕金森病疗效显著,能降低Hcy-水平,不良反应低。

平颤舒筋汤治疗早期帕金森病疗效及对多巴胺、神经营养因子、炎性因子的影响

目的探讨平颤舒筋汤联合西医疗法治疗早期帕金森病患者的疗效及对多巴胺、神经营养因子、炎性因子的影响。方法选择2021年1月—2022年1月在邯郸市中医院就诊的早期帕金森病患者60例,随机分为对照组和观察组各30例。对照组给予常规西医治疗,观察组在此基础上加用平颤舒筋汤口服,2组均连续治疗3个月。观察比较2组治疗前后帕金森病统一评分量表(UPDRSⅢ)评分、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分及脑内多巴胺和血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)水平,记录治疗过程中不良反应发生情况。结果与治疗前比较,2组患者治疗后UPDRSⅢ评分均明显下降(P均<0.05),MoCA评分及脑内多巴胺水平均明显升高(P均<0.05),观察组各指标改善情况均明显优于对照组(P均<0.05)。治疗后观察组患者血清TNF-α、IL-1β水平均明显低于治疗前及对照组(P均<0.05),血清VEGF、BDNF、IGF-1、GDNF水平均明显高于治疗前(P均<0.05),且VEGF、BDNF、IGF-1水平均明显高于对照组(P均<0.05)。对照组患者不良反应发生率为20.0%(6/30),观察组患者不良反应发生率为13.3%(4/30),2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论平颤舒筋汤治疗早期帕金森病疗效确切,有助于提高脑内多巴胺水平,可通过上调神经营养因子水平和下调炎性因子水平而保护神经元细胞,改善认知功能。

神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元存活和分化的影响

目的观察不同神经营养因子对体外培养中脑多巴胺能神经元（DN）存活和分化的作用。方法选取14d孕鼠,无菌条件下取出胎鼠,采用酶消化法培养中脑DN神经元,在培养过程中,分别加入不同浓度的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养因子3（NT3）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF）,通过细胞形态学和免疫荧光方法进行细胞纯度鉴定,观察不同作用条件下TH阳性细胞率确定细胞存活。结果以10--60ng/L的GDNF或BDNF持续培养10d,中脑多巴胺能神经元的存活率明显高于NGF和NT3作用组,浓度为20ng/m l的GDNF作用最强,能够维持60%的DN神经元存活。此外BDNF和GDNF能够增加DN神经元的数目,但未发现明显的剂量依赖效应,当GDNF与BDNF联合应用时,未见DN神经元的保护作用增强。结论GDNF和BDNF对原代培养的多巴胺能神经元存活具有较强的促进作用,并能诱导神经前体细胞分化为DN神经元。

神经营养因子对体外培养多巴胺能神经元营养作用比较研究

目的 :比较 5种神经营养因子对体外培养多巴胺能 (DA)神经元营养作用差别。方法 :在培养孕 14～ 16d大鼠胚胎黑质神经元中加入 5种神经营养因子 (NTF )。采用免疫组化染色及计算机图像分析系统对培养细胞进行观察。结果 :脑源性神经营养因子 (BDNF)、血小板源性生长因子 (PDGF)及碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)能促进中脑DA神经元发育 ,提高神经元及长突起神经元存活率。BDNF在整个培养期都有较强营养作用 ,PDGF在早期、bFGF在中期有轻度作用 ,神经生长因子 (NGF)和白细胞介素 6 (IL 6 )则无作用。结论 :体外DA神经元培养过程中 ,BDNF有较强的神经营养作用 ,PDGF和bFGF次之 ,NGF和IL

脑源性神经营养因子在脑室注射脂多糖大鼠黑质多巴胺能神经元变性中的作用

目的观察脑室内注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对大鼠黑质多巴胺能神经元的长时程毒性作用,探讨脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在黑质多巴胺能神经元慢性变性过程中的作用。方法健康雄性SD大鼠48只,采用抽签法将大鼠随机分为LPS实验组和0.9%氯化钠注射液(NS)对照组,经大鼠右侧脑室一次性注射LPS20μL(1.25g/L)或0.9%氯化钠注射液20μL。给药后2周、4周、12周、24周用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色观察黑质多巴胺能神经元的变化,免疫组化及酶联免疫吸附实验(enzyme immunoassay system,ELISA)检测黑质纹状体系统BDNF表达的变化。结果①TH免疫组织化学染色结果显示,大鼠黑质多巴胺能神经元数目在LPS给药后期减少,24周时LPS实验组大鼠黑质TH阳性神经元数量为NS对照组的75.4%(P<0.01);②BDNF免疫组化结果显示,LPS实验组大鼠4周时黑质部位BDNF阳性细胞的表达较NS对照组高,而到12周和24周时其表达比NS对照组明显下降。ELISA检测结果显示,LPS实验组大鼠4周时黑质纹状体内BDNF表达是NS对照组的186.3%(P<0.01),而12周和24周时分别是NS对照组的42.3%(P<0.01)和61.0%(P<0.05)。结论脑室内注射LPS可导致大鼠黑质多巴胺能神经元变性,这一病变过程呈慢性迟发性。该模型大鼠黑质TH阳性神经元变性丢失前即出现黑质纹状体系统BDNF表达减少,提示BDNF表达减少可能是黑质多巴胺能神经元变性丢失的原因之一。

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。材料:3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。方法:采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组:Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。主要观察指标:采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。结果:脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P<0.01)。对共培养7d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488nm和563nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。结论:胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。

胶质细胞系源性神经营养因子促进大鼠中脑多巴胺能神经元存活与分化的机制

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)促进中脑多巴胺(DA)能神经元存活和分化过程中,磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的可能作用。方法生后大鼠中脑脑片培养,并依培养基内加入的不同物质分为空白对照组、GDNF组、PI3K通路阻断组、MAPK通路阻断组。培养6 d后,进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色,光镜观察,计算机辅助图像分析,统计学处理;同时用Westernblotting方法检测脑片中TH的表达。结果GDNF组TH表达阳性神经元的形状更趋向成熟,其TH表达阳性神经元的密度、胞体大小和TH的表达水平均显著高于空白对照组;P13K通路阻断组TH表达阳性神经元几乎消失,其TH表达水平显著低于GDNF组而与空白对照组无显著差别;MAPK通路阻断组TH表达阳性神经元的密度及TH表达水平与GDNF组无显著区别,但TH表达阳性神经元胞体显著小于GDNF组。结论P13K通路参与介导GDNF对DA能神经元的促存活作用,而MAPK通路参与介导其促形态学分化作用。

脑源性神经营养因子对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的影响

目的 观察脑源性神经营养因子对帕金森病（Parkinson’s disease,PD）大鼠模型黑质多巴胺能神经元的影响。方法 选用Wistar种系大白鼠30只,体质量230~250g,随机分3组,通过左侧中脑黑质立体定向注射法,组1为生理盐水对照组（简称对照组）10只,注射相应量（5μL）的生理盐水;组2为注射6-OHDA制作帕金森病模型组（简称6-OHDA组）10只,注射6-OHDA,5μL（2μg/μL）;组3为（6-OHDA＋BDNF）组,在制成帕金森病模型后再向同侧中脑黑质注射BDNF 5μL（3μg/5μL）,连续6d,1次/d。分别观察动物的旋转行为,免疫组化染色方法观察黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）阳性神经元的数量,高效液相法测定纹状体部多巴胺（dopamine,DA）含量的变化。结果 单侧黑质内注入6-OHDA制成帕金森病大鼠模型后,6-OHDA组与对照组比较,产生旋转行为,（6-OHDA＋BDNF）组在观察旋转行为时,症状明显改善;镜下见TH阳性神经元主要见于对照组的黑质致密部,数量为（42.3±7.56）个/μm2,模型组黑质致密部TH阳性神经元数明显减少为（2.41±1.07）个/μm2,（6-OHDA＋BDNF）组黑质致密部TH阳性神经元数为（15.36＋3.04）个/μm2;纹状体部多巴胺含量：生理盐水组为（11.4±1.2）μg/g,6-OHDA组（3.6±0.5）μg/g,（6-OHDA＋BDNF）组（5.5±0.6）μg/g。结论 BDNF能改善6-OHDA所致的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元数目的减少;明显抑制6-OHDA引起的纹状体部多巴胺含量降低;并可抑制6-OHDA对黑质多巴胺能神经元的毒性作用。

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景:神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。目的:观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。方法:无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧+胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧+胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。结果与结论:在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。