猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析

应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性 E2抗原决定簇蛋白和全长 E2基因构建的 DNA疫苗免疫 BAL B/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经克隆和间接 EL ISA筛选 ,获得了 A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在 1∶ 80 0～ 1∶ 2 10 0 0 0之间。抗体类型鉴定结果表明 ,A11、E3、H6、D5和 D8为 Ig M类型 ,B2为 Ig G类型。随后用蛋白 A凝胶层析法和 PEG沉淀法分别纯化了 Ig G和 Ig M单抗。对纯化单抗进行的抗原识别表位研究结果初步表明 ,6株单抗可能识别 3种不同的E2抗原表位。

重组炭疽保护性抗原的表达、纯化与生物活性分析

构建分泌型表达质粒 ,在大肠杆菌中实现了重组炭疽保护性抗原 (rPA)的分泌型表达。重组蛋白位于细菌外周质 ,表达量约占菌体总蛋白的 10 %。以离子交换、疏水层析和凝胶过滤为基础 ,建立了rPA的纯化工艺 ,每升培养物可获得约 15mgrPA ,纯度可达 95 %以上。体外细胞毒性试验显示rPA具有较好的生物学活性。用rPA免疫家兔产生的抗血清在体外可抑制炭疽致死毒素的活性 ,表明rPA可诱导机体产生保护性免疫。

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面抗原ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染红细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活位点等的复合抗原基因（ＨＧＦＳＰ），先定向克隆人ｐＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切、补平及用ＳａｃⅠ单酶切下的目的基因再定向克隆人痘苗病毒表达载体ＰＪ２－１６的ＳｍａⅠ、ＳａｃⅠ位点，转化ＴＧ－Ⅰ宿主菌，重组子经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶分析及酶谱等鉴定，证实并筛选出了目的基因已插入到ＰＪ２－１６血凝素（ＨＡ）基因内的重组子，构建了恶性疟原虫抗原基因－痘苗病毒表达载体。将该重组表达载体与痘苗病毒天坛株经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ处理，在Ｃｏｓ－７细胞内进行共转染和同源重组，转染物接种ＢＨＫ２１细胞，经鸡红细胞吸附试验挑选不吸附鸡红细胞的病毒斑（ＨＡ－），共筛选出两株ＨＡ－重组病毒，用抗该目的基因大肠杆菌表达蛋白抗体对重组病毒表达产物进行间接免疫荧光、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等试验证明，两株重组病毒中有一株可表达目的蛋白，蛋白分子量与按目的基因长度?

针对炭疽保护性抗原不同结构域的中和性单克隆抗体的筛选和鉴定

炭疽保护性抗原(PA)是炭疽毒素的重要组分,同时也是现有炭疽疫苗的主要有效成分,在炭疽杆菌的致病与免疫中发挥关键作用。以重组PA为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,结合炭疽毒素敏感细胞的毒性中和试验,大量筛选抗PA单克隆抗体,获得了9株炭疽毒素中和性单抗。进一步分析表明这些单抗以IgG1亚类为主,分别识别PA3个结构域的4个不同中和表位区。针对结构域2的4株单抗识别同一表位区,其中3株单抗的中和活性强于抗PA多抗;针对结构域4的4株单抗识别两个不同表位区;另有1株单抗识别位于结构域3的表位。实验结果提示PA具有多个中和表位,分别位于其不同结构域,其中结构域2、4包含主要中和表位。实验中获得的针对不同表位的中和性单抗为深入研究PA的免疫保护机理提供了工具,也为研制针对炭疽毒素的被动免疫制剂和治疗药物打下基础。

肝片吸虫保护性抗原基因在卡介苗中的表达

用EcoRⅠ酶切含肝片吸虫保护性抗原基因FH3的重组质粒pUC18/FH3,回收FH3(约1.0kb)片段并测定其碱基序列 .FH3片段以正确相位插入到E .coli 分枝杆菌穿梭表达质粒载体pMV2 61中 ,构建含有肝片吸虫保护性抗原基因的重组穿梭质粒 .通过电转移法转化卡介苗 ,斑点杂交实验证明 ,重组卡介苗中含有此抗原基因 .热诱导FH3基因在卡介苗中的表达 ,并对基因表达产物进行SDS PAGE分析 结果显示 ,表达产物相对分子量为 2 2kD .

破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法,从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353 bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T载体进行测序,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS115和KM71,甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％。通过免疫印迹可以检测到重组表达产物。活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性。本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达。研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。

A型肉毒毒素保护性抗原基因的克隆及其结构分析

以文献报道的 A型肉毒神经毒素基因全序列为标准 ,设计并合成一对引物 ,从肉毒梭菌中扩增含保护性抗原表位的肉毒毒素重链 C端 (Bo NTa Hc)基因片段 ,并将扩增产物进行限制性内切酶消化 ,与相同酶处理的克隆测序载体 p Bluescript KS( +)在体外连接 ,构建测序重组质粒 ,进行测序和基因结构分析 .结果 :PCR扩增获得了产物为 12 75 bp大小的 DNA片段 ,测序结果与 DNA数据库对照检索分析证明 ,此基因片段与 Genbank中的 Bo NTa Hc基因的同源性为 99%,可以认为克隆的基因即为 Bo NTa

恶性疟原虫基因工程疫苗的研究——Ⅰ.恶性疟原虫保护性抗原复合基因的合成与克隆

本文应用基因工程技术,设计并化学合成了编码恶性疟原虫红内期保护性抗原MSA_1,MSA_2和RESA上多个免疫原性决定簇(含T、B细胞位点)以及来自白细胞介素-1(IL-1)和破伤风类毒素(TT)上的外源性T细胞激活位点的复合基因HGFC。全基因共由246个碱基对组成,编码一个75肽的复合抗原。合成后的基因克隆在M13mp18载体上,并经序列分析证实与设计完全一致。杂合基因合成和克隆的成功,为在基因水平上进行多价疟疾疫苗的蛋白质工程研究创造了条件。

猪链球菌2型毒力相关因子及保护性抗原研究进展

猪链球菌是在世界范围内传播的一个重要的人兽共患病原体,可引起猪的脑脊膜炎、肺炎、心内膜炎、败血病、关节炎等症状。在已分离的猪链球菌35个血清型中,猪链球菌2型（SS2）流行范围最广。1998年和2005年在中国江苏省与四川省暴发了人感染SS2的疫情,分别引起14人和38人死亡。

2-型猪链球菌保护性抗原RfeA的B细胞表位预测

以2-型猪链球菌（SS2）保护性抗原RfeA推定的氨基酸序列为基础,采用Kyte-Doolittle法分析蛋白的亲水性,Emini法预测蛋白的表面可能性,以及Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数;辅以Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法对蛋白二级结构中柔性区域的分析,预测SS2保护性抗原RfeA的B细胞表位。结果表明,推测RfeA的B细胞表位位于RfeA蛋白N-端第21~27、53-60、104~117、140~160区域。用多参数预测SS2保护性抗原RfeA的B细胞表位,为实验研究SS2的多表位疫苗奠定基础。

坏死梭杆菌FN(A)型毒力株保护性抗原筛选及初步鉴定

通过胰蛋白酶裂解坏死梭杆菌FN(A)型毒力菌株菌体,分别以菌体裂解物上清和沉淀作为抗原免疫家兔制备血清。利用SDS-PAGE/Western-blot技术在菌体中筛选出4种具有免疫原性的组分,通过免疫后的攻毒试验,筛选出1种具有免疫保护性的抗原。抗原分离纯化后,进行N端氨基酸序列测定、免疫试验及生物学特性研究,据试验结果可初步判定该抗原为溶血素类似物或一种新发现的抗原物质。该抗原不仅能使机体产生保护性免疫反应,而且不同菌株中此种抗原间可产生明显的交叉免疫。

牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

为筛选牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)交叉保护性抗原,本研究以A型Pm CQ2株基因组为模板,对其omp A、omp H、plp E、pm0979、P6和pfh B基因分别进行扩增,克隆于相应表达载体并进行原核表达,同时对表达产物进行纯化及western blot鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,分别测定其对2 LD50剂量的A型和B型Pm的攻毒保护效果。结果表明,重组蛋白r Omp A、r Omp H、r Plp E、r Pm0979、r P6和r Pfh B对A型Pm CQ2株的攻毒保护率分别为20%、60%、70%、40%、20%和10%,对B型Pm CVCC450株的攻毒保护率分别为0、30%、40%、20%、10%和0,表明重组蛋白r Plp E、r Omp H和r Pm0979可以针对不同血清型的Pm提供较好的交叉保护作用。本研究为牛源Pm新型疫苗的研制奠定了基础。

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的:通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原Hc(Bont/B-Hc)。方法:对Bont/B-Hc基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将(G+C)含量由76.2%降至56.3%;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont/B-Hc的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导Bont/B-Hc的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26.7%,表达量达到30mg/L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3%,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。

MDV和AIV主要保护性抗原基因在鸡痘病毒中的联合表达

将强启动子Ps插入载体7S中构建成插入载体7SP,将鸡马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白B(gB)基因和禽流感病毒(AIV)血凝素H9A基因共同克隆到插入载体7SP中,获得重组转移质粒7SPGA,通过酶切鉴定获得Ps-gB与P7.5-HA同向的转移质粒,再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA得7SPLGA,将质粒7SPLGA与禽痘病毒疫苗株共转染鸡成纤维细胞,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-Ps-gB-P7.5-HA,以间接免疫荧光法证实gB基因和HA基因同时得到表达。该研究为探索新型基因工程苗打下了良好的基础。

犬链球菌保护性抗原的鉴定

为克隆、表达犬链球菌(S.canis)保护性抗原基因,并对其表达产物进行免疫原性分析。本研究以Lambda ZAPⅡ载体构建了S.canis的3kb～8kb随机基因组文库,通过S.canis阳性血清筛选和质粒拯救,获得一株阳性克隆重组质粒并进行了序列测定。通过BLAST分析并与GenBank中登录的相近基因序列比较发现,该基因为S.canis的1个保护性抗原(SPASc)基因,该基因与兽疫链球菌和产脓链球菌的保护性抗原及马链球菌M蛋白基因具有一定的同源性。根据该序列设计特异性引物,经PCR扩增、克隆并进行了SPASc基因的原核表达。用纯化SPASc重组蛋白免疫兔制备的血清对小鼠具有保护性作用。

恶性疟原虫疫苗研究Ⅳ──恶性疟原虫保护性抗原复合基因(PfCMR)的克隆与高效表达

将恶性疟原虫保护性抗原复合基因（PfCMR）与表达质粒pWR450—1分别经BamHI、EcoRI双酶切后回收、纯化和重组并转化大肠杆菌JM109，再经含氨苄青霉素LB培基初筛后，挑白色菌落扩增，用PCR复筛和双酶切鉴定，阳性克隆子pWR450—1—B14用IPTG诱导，在JM109中表达。表达产物经SDS—PAGE分析，在65kDa处出现较宽的蛋白条带。用SOS显色法证实此表达蛋白具有β-半乳糖苷酶活性。表达的融合蛋白与抗恶性疟原虫多克隆免疫血清特异结合．其滴度高达1：3200；Westernblot分析显示，表达蛋白能与特异性抗体产生较强的免疫反应。上述结果提示表达的融合蛋白具有生物学和免疫学活性。

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的 为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法 根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 。

牛分支杆菌主要保护性抗原研究进展

牛结核病是一种人兽共患病,是世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的传染病,主要由牛分支杆菌引起,其蛋白可以诱导动物机体产生相应抗体。这些蛋白可以用来诊断结核病,对新型疫苗的研制也具有重要意义。因此,这些蛋白一直是分子生物学研究领域中的热点。论文就牛分支杆菌主要保护性抗原的特性及其在诊断中的应用进行了综述。

CHO细胞表达的抗炭疽保护性抗原人源化抗体的纯化及质量控制分析

目的:建立CHO细胞表达的抗炭疽保护性抗原人源化单抗纯化工艺和质量控制方法。方法:收获50 L生物反应器中无血清悬浮培养的CHO工程细胞培养液,通过高速离心去除细胞及碎片后超滤浓缩上清液,经亲和层析、SPFF阳离子交换层析后,将所得目的蛋白质经G25凝胶柱更换缓冲液以完成纯化;对纯化的产品进行单抗鉴别(Western印迹)、相对分子质量(SDS-PAGE和MOLDI-TOF)、纯度(SEC-HPLC)、生物学活性(毒素中和试验)、产品相关杂质(SEC-HPLC检测聚集体、降解产物)、工艺相关杂质(ELISA分析残余宿主蛋白、残余蛋白A)、安全性(凝胶法检测内毒素、薄膜过滤法考察无菌)分析。结果:样品回收率达61.7%;单抗鉴别实验阳性;MOLDI-TOF测定完整分子的相对分子质量为147 995,与预期相符;单体比例为99.25%,二聚体比例为0.75%;EC50值为0.1516μg/m L。残余宿主蛋白、残余蛋白A、内毒素、无菌检查结果符合药典要求。结论:初步建立了纯化工艺和质量控制方法,为抗炭疽人源化单抗药物的研制奠定了基础。