利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的电化学凝血酶蛋白生物传感器研究

介绍了一种利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的蛋白质生物传感器.以凝血酶蛋白为研究对象,利用凝血酶蛋白相对应的两段核酸适配体,将适配体Ⅰ固定在磁性颗粒上,用于特异性地捕获蛋白,将适配体Ⅱ标记金胶作为检测信标.由凝血酶蛋白和相对应的两段核酸适配体构建三明治结构的凝血酶蛋白生物传感器.另外,再通过信标金胶上过剩的核酸适配体链与另一段标记有金胶的互补核酸进一步杂交,获得金胶的选择性聚集,实现了信号扩增.通过信号扩增,使此传感器的灵敏度大大提高,对凝血酶蛋白的检测下限可达到4.52×10-15mol/L.平行测定浓度为7.47×10-14mol/L的凝血酶8次,其RSD为3.0%.该生物传感器对凝血酶蛋白有很好的特异性,其它蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白的存在对于检测没有影响.

用显微切割技术和催化信号扩增法检测何杰金病瘤细胞(H/RS)中的人巨细胞病毒

为明确何杰金病 (Hodgkin’sdisease ,HD)瘤细胞中是否存在人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)感染 ,采用显微切割技术结合PCR方法检测HD组织及其瘤细胞Hodgkin/Reed Sternberg(H/RS)中的HCMV核酸 ;采用免疫组织化学催化信号扩增 (catalysedsignalamplification ,CSA)法检测HD中HCMV的立即早期抗原、早期抗原和基质蛋白。结果在 5 4例HD中选取 13例HD的H/RS细胞 ,经显微切割分离后有 4例 (30 8% )经PCR扩增出HCMV的核酸 ;5 4例HD组织中 ,经PCR检测有 10例 (18 5 % )扩增出HCMV的核酸 ;CSA染色显示有 6例(11 1% )HCMV立即早期抗原和早期抗原 (DDG9/CCH2 )阳性 ,5例 (9 3 % )基质蛋白 (AAC10 )阳性。对照的 17例反应性增生淋巴结中HCMV核酸的PCR检测 ,以及三种HCMV抗原的CSA检测 ,均为阴性。表明HD组织的H/RS细胞中存在HCMV核酸和抗原 ,而反应性增生淋巴结中不存在 ,提示HCMV可能参与了何杰金病的发病过程。

原位杂交组织化学技术中信号扩增的研究进展

原位杂交组织化学(ISHH)技术是利用两条互补单链之间通过核酸分子碱基的氢键配对反应形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学方法,在核酸原有的位置上把它显示出来。目前它已是一种比较成熟的技术,因其能对核酸进行原位检测而得到广泛的应用。ISHH的种类很多,其方法的改进主要在于检测信号提高上目前用于信号扩增的方法主要有原位PCR侧链系统、酪胺信号放大、催化报告分子沉淀、尾探针原位杂交和原位引物延伸标记这些方法的建立,不同程度的提高了信噪比使ISSH的灵敏性增加并得到广泛的应用。

组织内微量抗原的催化信号扩增法检测

目的 探讨催化信号扩增法 (catalyzedsignalampli fication ,CSA)在检测组织内微量抗原中的作用及意义。方法 分别应用免疫组织化学ABC法和CSA法 ,对 5 4例霍奇金淋巴瘤 (Hodgkin’slymphoma ,HL)和 1例人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)感染的对照涎腺组织中 ,HCMV的立即早期抗原DDG9、早期抗原CCH2和低基质蛋白抗原AAC10进行检测 ,并比较阳性信号的强弱及阳性率。结果 应用ABC法 ,仅在 1例对照组织中检测到DDG9、CCH2及AAC10的弱阳性信号 ,在 5 4例HL中 ,未检测到任何阳性信号 ;而应用CSA法不仅对照组织中DDG9、CCH2及AAC10均呈强阳性 ,而且有 6例 (11.1% )HLDDG9/CCH2呈阳性 ,5例 (9.3% )HLAAC10呈阳性。结论 CSA是一种较ABC法敏感的免疫组织化学染色方法 。

基于信号扩增的荧光技术检测MicroRNAs的研究进展

基于信号扩增的荧光技术结合了荧光检测与扩增技术两者的优点,是一种拥有广阔发展前景的生化分析方法。因其具有扩增效率高、信号易于读取和实时分析等优点,正成为核酸检测中的一个研究热点。文中综述了近年来基于信号扩增的荧光技术应用于micro RNAs检测的最新进展,包括链置换扩增、滚环扩增、基于外切酶的信号扩增、基于双链特异性核酸酶的信号扩增和无酶信号扩增等,并对今后的发展方向进行了展望。

通用模板信号扩增技术

CR是最常用的分子生物学诊断技术 ,但目前常用的PCR都存在种种不足 ,制约了其在临床的应用。我们在Taq man荧光PCR的基础上开发了通用模板信号扩增技术 (UT PCR)比较好的解决了传统PCR核酸模板质量容易引起的假阴性以及难以实现多基因 /多位点同时检测两大难题。UT PCR具有灵敏度高、特异性强、假阴性低 ,并能实现高通量检测 ,在临床诊断和科学研究中有广泛的应用空间。

通用模板信号扩增技术(UT-PCR)

PCR是最常用的分子生物学诊断技术,但常用的PCR都存在种种不足,制约了其在临床的应用。通用模板信号扩增技术(UT-PCR)解决了传统PCR核酸模板质量容易引起的假阴性以及难以实现多基因/多位点同时检测两大难题。UT-PCR具有灵敏度高、特异性强、假阴性低,并能实现高通量检测,在临床诊断和科学研究中有广泛的应用空间。

不对称PCR结合滚环扩增信号放大技术检测牛肉中单增李斯特菌

建立一种不对称聚合酶链式反应结合滚环扩增信号放大(Rolling circle amplification,RCA)的技术,对牛肉中单增李斯特菌进行快速灵敏检测。通过改变上下游引物的浓度,扩增得到一条带有通用序列的单链DNA,进而引发RCA反应,产生大量的G-四链体序列,硫黄素T嵌入G-四链体序列中产生荧光信号,从而实现对单增李斯特菌的检测。在最优的条件下,本研究所建立的方法对单增李斯特菌在PBS中的检测限为3.6×101 CFU/mL;在加标的牛肉中,其检测限达到了3.6×102 CFU/g。本研究所建立的方法可实现单增李斯特菌的快速检测,通过改变特异性的引物,该方法也可用于其他食源性致病菌的检测,具有较高的推广应用价值。

分枝链DNA信号扩增试验定量检测慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA

观察干扰素治疗过程中ＨＥＶＤＮＡ量的变化。方法与结果对－组ｅ抗原阴性ＨＢＶＤＮＡ阳性用干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者，用分枝链ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）信号扩增试验、聚合酶链反应及膜杂交试验检测血清中ＨＢＶＤＮＡ，其检出率分别为７６．５％、１００％和４７．１％用ｂＤＮＡ信号扩增试验观察了这组患者在干扰素治疗过程中ＤＮＡ含量的变化，发现８２．４％的患者治疗后ＤＮＡ降至低于检测水平，其中３２％的患者出现反跳；６１．８％的思者血清ＤＮＡ含量变化与ＡＬＴ反应相一致。结论ｂＤＮＡ信号扩增试验可定量检测病毒核酸，是考核抗病毒药物疗效的较好方法。

G-四链体序列筛选及G-四链体等温信号扩增体系的构建

G-四链体序列可与Hemin结合形成具有过氧化物酶活性的DNAzyme,被广泛应用于生物传感器的构建中。G-四链体的过氧化物酶活性高低对生物传感器构建至关重要。本研究利用圆二色谱比较分析了生物传感器中常用G-四链体序列的空间构型,筛选出过氧化物酶活性高的G-四链体序列,并比较了G-四链体中鸟苷酸聚集单元数、K+及Hemin对其过氧化物酶活性的影响。本研究应用高过氧化物酶活性的G-四链体作为可视检测信号核酸分子设计了一种可用于核酸检测的G-四链体等温信号扩增体系,不同于通常核酸检测方法直接对目标序列进行扩增,该体系在等温条件下,通过剪切与置换进一步大量扩增作为信号分子的G-四链体序列,致使整个核酸检测过程更为简便,为生物传感器构建、新型核酸检测技术研发提供了新的思路和技术支持。

核酸体外扩增技术

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础。随着生物技术的发展 ,出现了越来越多的核酸体外扩增技术。根据其特点可分为两类 :一类是靶核酸的直接扩增 ,如聚合酶链式反应、链替代扩增、连接酶链式反应、核酸依赖的扩增、Qβ复制、转录介导的扩增和滚环扩增等 ;另一类是信号放大扩增 ,如支链DNA、侵染探针等。就现有的核酸扩增技术的原理。

3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法比较及结果分析

目的对检测乙型肝炎病毒（HBV）YMDD变异的3种方法进行比较并分析结果。方法对101例用拉米夫定治疗的HBV感染者，测定其治疗前HBV DNA水平，定期随访，分别以通用模板信号扩增（UT-PCR）、限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）和DNA测序法检测病毒YMDD变异。结果UT—PCR和PCR-RFLP的检测结果与DNA测序结果的符合率均为98．11％。按治疗前HBV DNA水平分为5×10^2～5×10^4拷贝／mL，5×10^4～5×10^6拷贝／mL，5×10^6～5×10^8拷贝／mL，〉5×10^8拷贝／mL4个组，YMDD变异率分别为10％，12．90％，32．43％和53．85％。YMDD突变后，HBV DNA水平显著降低，其中WDD突变株的HBV DNA水平高于YIDD突变株（P〈0．01）。结论UT-PCR法适合临床检测HBV YMDD变异。乙型肝炎患者用拉米夫定治疗时，病毒DNA水平越高，发生YMDD变异的几率越大。突变株的复制能力低于野生株，YVDD突变株复制能力强于YIDD突变株。

HIV-1病毒载量检测常用技术及研究进展

病毒载量检测是HIV-1感染后需要长期观察的重要指标,在基础研究、早期感染的诊断、药物治疗学研究和流行病学监测方面都有特殊的意义。目前普遍使用的HIV病毒载量检测主要是测定血浆中病毒RNA的量,采用的方法包括荧光定量PCR技术、核酸等温扩增技术以及分支DNA杂交技术等。检测的样本包括血清、分泌物及全血制备的干血斑等多种类型,检测的靶点也会涉及到细胞基因组中整合的病毒DNA的应用。反转录酶法检测技术和其他等温扩增技术等许多技术已用于实验检测,一些交叉学科技术正进行着实验性探索。我国已有HIV-1病毒载量检测实验室140余家,3种经典的检测技术均有涉及。各种技术特点不同,但在病毒载量检测工作中均发挥巨大的作用。

非荧光硫化锌纳米簇的合成与表征

合成硫化锌纳米簇并对其进行表征,建立一种利用硫化锌纳米簇的阳离子交换(CX)反应检测痕量生物分子的方法。采用水热法合成非荧光硫化锌纳米簇(NCCs)并对其进行表征。纳米簇的性能直接影响检测结果。通过透射电镜图像和X射线衍射可知,纳米簇是多孔的,可以通过快速阳离子交换反应从纳米簇中释放大量的Zn2+,在锌响应试剂的作用下产生荧光信号进行荧光检测。其晶体的外部比内部排列松散,有利于快速阳离子交换,其晶体尺寸大小与加热时间有关。通过比表面积检测法测定纳米簇的表面积和孔径表明,最小的纳米簇拥有相对较大的表面积及较高的阳离子交换效率。实验了三种释放方法(酸溶解法、阳离子交换法和微波辅助阳离子交换法)对Zn2+释放性能的影响,结果表明,微波辅助阳离子交换法信噪比较高,操作简便,可用于硫化锌纳米簇免疫测定法中。比较了Zn2+的释放效率和目标结合力与平均直径之间的关系,结果表明纳米簇尺寸为44nm时表现出最高的阳离子交换效率。结论:所有这些特点,使ZnS纳米簇阳离子交换放大器在痕量生物分子检测方面成为高度灵敏、生物相容性好、低廉环保的检测工具。

脱氧核糖核酸电致化学发光传感技术的研究

电致化学发光(ECL)由电化学反应直接或间接引发,具有灵敏度高、选择性好、易实现实时化和集成化、可进行原位检测的优点,为生命科学进入到分子水平研究提供了有力的方法。脱氧核糖核酸(DNA)研究是生命科学领域中极为重要的内容,特定DNA序列的定量检测在法医鉴定、疾病预防、环境监测等领域,尤其是对疾病的早期准确诊断及治疗具有重要意义。DNA-ECL传感技术,被认为是最有发展前景的一类DNA分析方法,是当今生物学和医学领域的前沿性研究课题。本文重点评述了国内近5年DNA-ECL传感技术的研究工作,最后对其研究前景进行了展望。

乙型肝炎患者血清中HBVDNA的临床意义

目的研究乙型肝炎病毒定量与疾病发生、发展的关系。 方法采用分子链信号扩增技术 (bDNA) ,检测 172例乙肝患者血清中HBVDNA。 结果各类型肝病患者血清病毒定量 <0 .7mmol/ml者所占各自比率分别为 :急性 88.0 % ,慢性 32 .3 % ,慢性重型 6 6 .7% ,肝硬化 19.4% ,肝癌 5 0 .0 %。 46例慢乙肝肝活检显示 :纤维化程度35岁以上组明显高于 35岁以下组 (P <0 .0 1)。而 96例慢乙肝病毒定量 35岁以下组明显高于 35岁以上组 (P <0 .0 1)。 结论HBV的存在与复制是导致肝组织病变的最根本因素。

乙型肝炎病毒YMDD变异不同检测方法比较与评价

目的比较检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的3种不同方法,评价其在监测拉米夫定抗HBV治疗中发生耐药突变的价值。方法对80例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者,测定其治疗前后血清HBVDNA含量、ALT水平变化,分别用聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)、通用模板信号扩增(UT-PCR)技术、以及基因测序3种方法进行HBVYMDD变异检测,并分析结果。结果80例患者用基因测序法检测出34例发生YMDD变异,变异发生率为41.25%;用PCR-ELISA法检测出21例变异阳性,与基因测序检测出的阳性率差异有显著性(χ2=4.68,P<0.05),两者结果的符合率为61.76%;用UT-PCR法检测出33例变异阳性,与基因测序检测出的阳性率无统计学差异(χ2=0.03,P>0.05),两者结果的符合率为97.06%。结论基因测序和UT-PCR方法检测HBVYMDD变异非常可靠,是监测拉米夫定耐药株的非常有效的方法,UT-PCR方法更适合临床应用,而PCR-ELISA方法需提高其敏感性。

器官移植后巨细胞病毒的院内感染:检测与监测

背景:巨细胞病毒是器官移植患者最易感染的机会性病毒之一,严重者可导致移植器官失去功能甚至危及生命,因此早期准确诊断巨细胞病毒感染是临床治疗的关键。目的:对器官移植后巨细胞病毒感染的检测方法、准确程度、检测时间和临床意义分析。方法:通过计算机分别检索维普数据库、Pub Med数据库和中国知网数据库2007年1月至2014年12月有关器官移植和巨细胞病毒感染的文献,以及通过手工查阅书籍,以"transplantation,cytomegalovirus"为英文检索词,"器官移植,巨细胞病毒"为中文检索词。共检出中文31篇,英文1 894篇,选择代表性好、相关领域权威杂志的文献共35篇做进一步分析。结果与结论:对巨细胞病毒活动性感染的无创检测仍然是以巨细胞病毒-pp65抗原为主,该方法可以准确反映巨细胞病毒感染的状况,敏感性和特异性均较好,也是临床上最具诊断价值的方法。对巨细胞病毒的分子进行生物学检测可以从可以帮助检出潜在的感染人群,而且其检出时间比巨细胞病毒-pp65抗原早,适用于巨细胞病毒感染的早期诊断和抢先给药治疗。定量核酸检测技术可通过定量的分析巨细胞病毒-DNA的拷贝数判断患者体内的病毒含量,为判断隐性感染的患者提供了更为灵敏的监测方案。血清中巨细胞病毒-IgG和巨细胞病毒-IgM可以判断器官移植受者是否感染过巨细胞病毒以及后期的发病风险。病毒培养以及组织学的检测已经沿用数年,这两者是检测巨细胞病毒的金标准,但这些方法对于早期发现感染和诊断活动性感染意义不大。免疫学检测方法为诊断巨细胞病毒感染提供了新的思路,巨细胞病毒特异性的细胞的监测可以从早期、动态、准确的监测巨细胞病毒在体内的发展,评估巨细胞病毒发病风险,为巨细胞病毒感染的诊断发展提供新途径。