信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。

G蛋白信号调节因子-13通过调控β-catenin抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探究G蛋白信号调节因子-13(RGS13)在结直肠癌(CRC)进展中的作用。方法:使用TCGA数据库和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)在mRNA水平分析CRC组织和细胞中RGS13的表达量,使用免疫组织化学染色(IHC)和蛋白质印迹法(Western blot)在蛋白水平进一步分析。用ATP细胞活力检测实验、软琼脂克隆集落形成实验和细胞迁移侵袭实验检测RGS13对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并通过Western blot、RT-q PCR等实验探究其下游分子机制。结果:RGS13在CRC组织与细胞系中低表达(P<0.01),RGS13表达越低,患者的无病生存期越短(P=0.017)。RGS13的下调可显著促进CRC细胞的增殖、迁移与侵袭(P<0.01),表明RGS13在CRC进展中发挥抑癌作用。机制上,RGS13通过下调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的蛋白水平,进而降低癌基因c-Myc、MMP7和CCND1等的表达水平(P<0.01),发挥对CRC的抑制作用。结论:RGS13可能通过下调β-catenin发挥抑制CRC进展的重要作用。

原发性高血压患者G蛋白信号转导调节蛋白-2基因的测序分析

目的在新疆哈萨克族原发性高血压患者中进行测序分析,寻找新的G蛋白信号转导调节蛋白-2基因序列变异。方法选择新疆哈萨克族原发性高血压患者94例,抽取静脉血提取DNA。采用PCR产物直接测序法,对94例样本的外显子区及其侧翼序列进行测序,检测G蛋白信号转导调节蛋白-2基因变异情况。结果 94例样本共检测出13个变异位点,包括5个常见变异和8个新发现变异位点,其中启动子区变异7个,内含子2个,外显子1和外显子5各检出1个新的错义突变(K18N和Y178C);-638A>G、-395G>C、1891-1892TC I/D和2971G>C以及-43A>T和2297A>G之间存在连锁不平衡关系(r2≥0.8)。结论 RGS2基因在新疆哈萨克族高血压患者中检出的变异位点及频率存在种族特异性,外显子区的错义突变频率较低,是否影响血压调节需进一步的功能验证。

雌激素受体α与细胞外信号调节蛋白激酶和血管内皮生长因子在甲状腺癌组织中的表达及意义

目的探讨雌激素受体α(ERα)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1)和血管内皮生长因子(VEGF)在人甲状腺乳头状癌各组织学类型中的表达及其相关性。方法采用免疫组织化学链霉亲和素-过氧化物酶(SP)法对59例甲状腺乳头状癌(PTC),56例甲状腺腺瘤和30例正常甲状腺组织中ERα、ERK1和VEGF的表达进行检测。结果 ERα在PTC、甲状腺腺瘤和正常甲状腺中的阳性表达率分别为83%、59%和30%,差异有统计学意义(P<0.05);ERK1在PTC、甲状腺腺瘤和正常甲状腺中的阳性表达率分别为69%、48%和23%,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF在PTC和甲状腺腺瘤中的阳性表达率分别为64%和39%,而在正常甲状腺无表达,3组之间差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移率较高的高细胞型和弥漫硬化型PTC中ERα、ERK1和VEGF的阳性表达显著高于淋巴结转移率较低的乳头状微癌(P<0.05)。在PTC中ERα与ERK1和VEGF的表达呈正相关(rs=0.486,P=0.000和rs=0.419,P=0.001)。结论 ERα对甲状腺滤泡上皮的增生和分化以及甲状腺肿瘤的血管生成均有促进作用,其过度表达与甲状腺癌的发生发展有关系。

神经病理性疼痛大鼠脊髓中MEK-ERK与NF-κB信号途径的变化

目的研究神经病理性疼痛大鼠脊髓中丝裂原激活/细胞外信号调节激酶-细胞外信号调节蛋白激酶(MEK-ERK)与核转录因子κB(NF-κB)信号途径的变化,探讨神经元和星形胶质细胞激活过程中信号途径的变化及意义。方法12只雌性SD大鼠(体重150～200g)随机均分为坐骨神经保留性神经损伤组(SNI组)和对照组(C组)。分别于术前3d、术后即刻、术后1、3、5、7、9、11d测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。术后11d测定缩腿反应的次数后,每组取3只大鼠用于灌注,应用免疫组织化学方法检测脊髓丝裂原激活/细胞外信号调节激酶(MEK)、磷酸化丝裂原激活/细胞外信号调节激酶(p-MEK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激(p-ERK)、NF-κB的表达。另3只大鼠断头处死后分离L4～6脊髓,提取大鼠脊髓的蛋白质,应用WesternBlot方法检测p-MEK、p-ERK、NF-κB表达。结果SNI组p-MEK、p-ERK、NF-κB表达高于C组(P<0.05)。MEK表达于胞浆,p-MEK表达于细胞核;p-ERK主要表达于星形胶质细胞。结论在神经病理性疼痛大鼠脊髓中,星形胶质细胞MEK-ERK信号途径被激活,脊髓背角深层神经元的NF-κB处于激活状态。

纳米金抑制Ang-2和RGS-5表达导致裸鼠肝癌血管正常化

目的:观察纳米金在一定时间窗内,对裸鼠H22肝癌组织中血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)、G蛋白信号调节蛋白-5(RGS-5)表达及肝癌血管正常化的影响。方法:6周龄BALB/c裸鼠48只,从右腋皮下注入H22肝癌细胞,肿瘤形成约3～4 mm大小,随机分为对照组(12只,注入生理盐水)和实验组(36只)。实验组从肿瘤周围及瘤内注入纳米金溶液0.2 mL(浓度为500 nmol/L),每天1次;连续给药3 d、7 d、11d后,分批处死12只,取肿瘤标本,用免疫化学染色法检测Ang-1、Ang-2及RGS-5的表达,并用电镜观察肿瘤血管壁周细胞形态。结果:(1)Ang-1在纳米金治疗后第3 d、第7 d及第11 d阳性率分别为16.7%、50.0%和16.7%,均高于对照组(8.3%),差异显著(P<0.05);其中实验组第7 d时Ang-1阳性率最高,与其在第3 d、第11d时比较,差异显著(P<0.05)。Ang-2在纳米金治疗后第3 d、第7 d及第11 d阳性率分别为33.3%、16.7%和41.7%,均低于对照组(58.3%),差异显著(P<0.05);其中Ang-2在第7 d时阳性率最低,与其在第3 d、第11 d时比较,显著差异(P<0.05)。(2)RGS-5在纳米金治疗后第3 d、第7 d和第11 d阳性率分别为33.3%、16.7%和50.0%,其中第7 d阳性率最低;低于对照组(50.0%)及第3 d、第11 d实验组,差异显著(P<0.05)。(3)不成熟周细胞覆盖率在纳米金治疗后第7 d时最低,为19.6%±4.3%,低于对照组(64.8%±11.7%)及第3 d(32.5%±7.9%)、第11 d(41.2%±9.1%)实验组,差异显著(P<0.05)。电镜观察见实验组裸鼠在纳米金治疗后第7 d血管外壁周细胞形态多数趋于正常,完整覆盖内皮细胞;而对照组周细胞形态大小不一、结构不完整,对内皮细胞覆盖少。结论:纳米金在其用药7 d时间窗内,能最大限度地通过抑制Ang-2和RGS-5在裸鼠肝癌组织中的过度表达,减少不成熟周细胞对新生血管的覆盖,使裸鼠肝癌血管正常化。

siRNA沉默MEKK3基因促进TRAIL诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡

目的:研究抑制促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶-激酶3(mitogen-activated protein/extracellular signal regulated kinase-kinase 3,MEKK3)基因表达促进TRAIL诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用,寻找乳腺癌临床治疗新策略。方法:应用MTT法检测人TRAIL对MCF-7细胞生长的抑制作用。合成MEKK3-siRNA,应用脂质体介导MEKK3-siRNA转染入人乳腺癌细胞MCF-7,以RT-PCR和Western blotting法检测MCF-7细胞MEKK3 mRNA和蛋白的表达。应用MTT法和流式细胞术检测MEKK3-siRNA与TRAIL联合处理后MCF-7细胞的增殖和凋亡。结果:TRAIL具有抑制MCF-7细胞增殖作用,但其抑制作用较弱。MEKK3-siRNA转染后能有效而稳定地抑制MCF-7细胞中MEKK3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。TRAIL与MEKK3-siRNA联合处理MCF-7细胞较TRAIL单独处理更明显地抑制细胞增殖活力(P<0.05),更明显地增加细胞凋亡率(P<0.01)。结论:siRNA沉默MEKK3基因能显著促进TRAIL对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的诱导作用,为探讨乳腺癌治疗新方案提供了实验依据。

CEF新辅助化疗对乳腺癌MAPK/PI3K通路的影响

目的通过检测CEF方案新辅助化疗前后乳腺癌组织中pMEK和pAKT蛋白水平的改变,分析该方案疗效与MAPK和PI3K信号通路之间的关系。方法选取Ⅱ～Ⅲ期乳腺癌患者54例,行CEF方案新辅助化疗。检测患者化疗前和手术后肿瘤标本中pMEK和pAKT蛋白的表达情况,分析该化疗方案对患者pMEK、pAKT的影响和化疗效果之间的关系。结果化疗后达到PR 42例,SD 7例,PD 5例,有效率77.78%(42/54)。pMEK及pAKT的表达与化疗效果均呈负相关(P<0.05)。化疗后pMEK及pAKT的表达水平下降(P<0.05)。结论CEF方案化疗可通过抑制MAPK和PI3K通路的关键蛋白pMEK和pAKT的表达发挥治疗作用,但对pMEK和pAKT高表达的患者疗效欠佳。检测这两条通路的关键蛋白pMEK和pAKT可能对指导乳腺癌化疗和判定疗效有一定价值。

纳米金联合5-氟尿嘧啶对裸鼠肝癌血管及肿瘤生长的影响

目的观察纳米金联合5一氟尿嘧啶（5一Fu）对裸鼠H22肝癌血管及肿瘤生长的影响。方法6周龄BALB／C裸鼠21只，从右腋皮下注入H22肝癌细胞，肿瘤形成直径7～8mm大小，随机分3组。5．Fu单药组从肿瘤周围及瘤内注入5-Fu溶液0．2ml（浓度为1．25g／L）；联合组则增加注射纳米金（浓度为500nmol／L）溶液0．2ml；对照组用等量生理盐水处理，连续用药7d。处死裸鼠，测量肿瘤体积。免疫组织化学染色计算肿瘤微血管密度（MVD）、微血管成熟周细胞覆盖度（MPI）。Westernblot检测G蛋白信号调节蛋白-5（RGS-5）的表达。高效液相色谱检测肿瘤组织中5一Fu的浓度。结果（1）联合组、单药组及对照组其肿瘤体积分别为（1．487±0．859）、（2．137-I-1．047）、（5．462±1．233）cm3；肿瘤MVD分别为（23±7）、（43±12）、（67±17）血管数／mm2；肿瘤MPl分别为（69．7±16．2）％、（37．5±11．3）％、（17．3±9．4）％。联合组在降低肿瘤体积、MVD及提高MPI方面，较单药组及对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）联合组与单药组其肿瘤组织内5．Fu浓度分别为（8．25-I-0．66）、（5．37±0．41）mg／L。联合组其化疗药物浓度明显高于单药组，两者差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）Westernblot检测联合组RGS-5表达量较单药组及对照组减少。结论纳米金能提高5-Fu在实体瘤内浓度，增强抗肿瘤生长作用；纳米金可以抑制RGS-5蛋白表达、上调MPI，影响肿瘤血管形态。

整合素相关蛋白及其配体在糖脂代谢中的作用

整合素相关蛋白（CD47）是在体内广泛分布的跨膜蛋白,其主要配体包括信号调节蛋白-α（SIRP-α）与血小板反应蛋白（TSP）-1.近年来,CD47与其主要配体在糖、脂代谢方面的研究取得了多方面的突破,尤其是与饮食诱导的肥胖、1型糖尿病的发生以及胰岛素功能的调节都有一定的相关性.探索CD47及其配体在糖、脂代谢中的作用机制,将为治疗糖尿病及肥胖提供新思路和潜在靶点.

PD 98059对食管癌细胞放射敏感性影响的研究

目的探讨PD 98059通过抑制丝裂原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MRPK-ERK)信号通路是否改变食管癌细胞的放射敏感性。方法用食管癌细胞株EC9706为实验对象,分别接受单纯放射、PD 98059和二者结合处理。通过Western印记法证实PD 98059可下调ERK活性。采用成克隆法定量分析细胞增殖性死亡。通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果单纯PD 98059(10μmol/L)可抑制ERK的磷酸化,而单纯放射对ERK的活性无明显影响,二者结合可提高对ERK活性的抑制作用。PD 98059(10μmol/L)在放射前与细胞作用1h及放射后作用10d均可提高EC9706细胞对放射的敏感性。PD 98059结合放射可增加EC9706细胞增殖性死亡,D0值的放射增敏比为1.69。PD 98059可增加EC9706细胞放射后诱导的细胞凋亡。结论PD 98059通过抑制MAPK降低ERK活性,增加EC9706细胞对放射的敏感性,为筛选放射敏感剂临床实验提供了依据。

ERK5对人肺成纤维细胞自噬、凋亡和增殖的调控

目的探讨细胞外信号调节蛋白激酶-5(ERK5)对人肺成纤维细胞系(HLFs)自噬、凋亡和增殖的调控及对成纤维细胞表型转化的影响。方法转化生长因子β1(TGF-β1)诱导HLFs建立肺纤维化细胞模型,过表达ERK5基因(ERK5)后通过Western blot检测自噬、凋亡、增殖相关因子和表型转化标志因子α-SMA的表达,通过细胞增殖/毒性检测(CCK8)试剂盒检测细胞增殖率。结果经TGF-β1处理后,与对照组相比,ERK5组细胞α-SMA、P62蛋白表达水平升高,LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平降低;促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表达水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原PCNA表达水平升高,CCK8检测到细胞增殖率升高。结论在TGF-β1诱导的HLFs表型转化过程中,ERK5高表达促进细胞增殖、抑制细胞自噬和凋亡。