长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。

烟实夜蛾信息素结合蛋白3 cDNA的克隆、序列分析与原核表达

利用RT-PCR技术从烟实夜蛾Helicoverpa assulta( Hass)雄虫触角中扩增得到了信息素结合蛋白3( HassPBP3)。克隆和测序结果表明,该基因核苷酸序列全长495 bp,编码164个氨基酸残基,预测分子量18.5 kD。并预测N-末端疏水区包含由22个氨基酸组成的信号肽。因此,成熟蛋白应包括142个氨基酸,预测分子量为16.1 kD,等电点为5.44。经氨基酸序列同源性分析发现,此序列与已知昆虫PBP3有较高的同源性,而且具有气味结合蛋白的典型特征。将该基因重组到表达载体pGEX-4T-2中进行原核表达。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析和Western印迹检测,结果表明烟实夜蛾PBP3基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约42 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。

家蚕信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的初步鉴定及表达分析

嗅觉对昆虫的生存、繁殖等起着重要的作用。依据家蚕Bombyxmori全基因组序列设计特异引物,扩增得到了两个信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的cDNA片段。结合已报道的家蚕信息素结合蛋白BmPBP1和两个普通气味结合蛋白BmGOBP的信息,对其基因结构分析表明,这5个基因均由3个外显子组成,具有保守的外显子/内含子边界和典型的6个Cys残基,且3个PBP基因在基因组上串联分布。序列同源性分析表明,BmPBP2和BmPBP3与烟草天蛾的PBP2和PBP3的同源性高达69%和63%。半定量RT-PCR分析结果显示,BmPBP2和BmPBP3基因在成虫触角中特异表达,且雌雄表达水平相当。这些结果表明BmPBP2和BmPBP3可能起着性信息素识别的作用。

棉铃虫信息素结合蛋白2cDNA的克隆、表达与组织特异性表达

【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrapFF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2(GenBank登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457bp,编码149个氨基酸残基,前端是一段25个氨基酸长的信号肽,推测蛋白具有昆虫信息素结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征。棉铃虫HarmPBP2在雌雄成虫的触角、足和翅中都有表达,另外在雌虫下颚须也有表达。雌雄组织表达量顺序相同,触角中表达量最高,翅中次之,足中最少。雌虫组织中表达量高于雄虫。构建的原核表达载体pGEX/HarmPBP2,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出一个分子量约为40kD的融合蛋白,经亲和层析纯化与酶切得到去标签的HarmPBP2蛋白。【结论】克隆、分析和表达了棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA序列,并对其进行纯化,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础,同时对其表达谱进行了研究。

中华蜜蜂信息素结合蛋白OBP10的基因克隆、原核表达和配基结合特性分析

【目的】气味结合蛋白在中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉系统中起到重要作用,本实验拟研究中华蜜蜂一个新的信息素结合蛋白OBP10及其与蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物的结合特性。【方法】本实验通过RT-PCR扩增获得OBP10基因全长(Gen Bank登录号:KP717060.1),以p ET-30a构建原核表达载体,并以Ni2+琼脂糖柱进行重组蛋白表达和分离纯化,在N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子下利用荧光光谱法体外研究重组Acer OBP10与多种候选化学配基的结合特征。【结果】经多序列联配分析,发现Acer OBP10的多个同源基因均为信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)。配基结合特性分析显示,Acer OBP10对14种候选配基中的蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)竞争力最大,相对荧光可降至6.06%,解离常数11.04μmol/L;进一步表明Acer OBP10属于一个新的中蜂PBPs。此外,Acer OBP10也能和包括工蜂信息素(香叶醇和橙花醇)、报警信息素(2-庚酮和乙酸异戊酯)等蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物之一的β-紫罗兰酮结合,表明Acer OBP10可能是一种以信息素结合为主的多功能结合蛋白。【结论】Acer OBP10是中蜂一个新的信息素结合蛋白,与此前我们鉴定的蜂王信息素结合蛋白Acer ASP1相比,Acer OBP10对蜜蜂信息素的结合谱更为广泛,这些结果将对进一步研究中华蜜蜂信息素识别和传递提供理论基础,对于深入了解中华蜜蜂嗅觉影响生理功能的行为机制具有重要意义。

昆虫信息素结合蛋白及其分子运输机制和生理功能研究进展

昆虫信息素结合蛋白是气味结合蛋白多基因家族的一个分支,在昆虫识别性信息素过程中起重要作用。该文从信息素结合蛋白的分子特征、与信息素分子的结合及释放机制、生理功能和进化基因组学等方面进行了综述,针对鳞翅目昆虫进行了重点阐述。

烟夜蛾性信息素结合蛋白2(PBP2)基因的克隆、序列分析与时空表达

性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在昆虫雌雄间信息交流中起着重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guenée)雄虫触角中克隆了性信息素结合蛋白2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%~91%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigeraPBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescensPBP2的序列一致性高达91%。时间表达和组织表达分析显示,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中期,且只在雌、雄成虫触角中表达。

中华蜜蜂信息素结合蛋白ASP1 cDNA的克隆及时空表达

信息素结合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）在昆虫信息素的识别、传递和处理过程中具有重要作用。本研究首次克隆r中华蜜蜂Apis cerana cerana的一个PBP基因Ac-ASP1（GenBank序列号为DQ449670），其预测蛋白具有典型的气味结合蛋白（OBPs）标志（即成熟肽含有6个保守的半胱氨酸）。利用real-timePCR技术对Ac-ASP1在中蜂不同组织和发育历期的时空表达谱进行了鉴定。绝对定量结果显示Ac-ASP1高丰度地表达于工蜂触角（2.07×10^6拷贝数/μg），而在其他组织（如头、胸、腹、翅及足）中呈低丰度表达（10^2拷贝数／μg）；相对定量结果显示Ac-ASP1在各发育历期如幼虫、蛹以及成虫发育早期（1-6日龄）均有大量表达，而在21日龄前后具有另外一个高丰度表达时期。这些结果可为明确Ac-ASP1在中蜂蜂王信息素信号识别传递过程中的作用提供参考。

苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表达

【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列,并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达,为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总RNA,利用RT-PCR、3′-RACE和5′TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列;通过构建原核表达载体pET28aCpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测;并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链,以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′TAILPCR扩增,得到CpomPBP2基因约3 000bp的全长序列;测序结果表明,CpomPBP2基因开放阅读框长约510bp,编码169个氨基酸,预测的成熟蛋白分子质量为16.45ku,等电点(pI)为5.09。经SDS-PAGE电泳分析表明,融合蛋白CpomPBP2以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为20ku。Western blot鉴定结果显示,获得了目标蛋白CpomPBP2。用终浓度1.0mmol/L IPTG诱导8h后,可获得大量融合蛋白。【结论】获得CpomPBP2的全长序列,成功构建了CpomPBP2的原核表达载体,经Western blot鉴定,CpomPBP2表达正确。

草地贪夜蛾4个性信息素结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

草地贪夜蛾是世界性的重大害虫,2019年1月入侵我国并迅速扩散到20多个省市。性诱剂是对草地贪夜蛾进行监测和诱杀的有效手段,但是其作用识别机制仍不清楚,限制了高效性诱剂的研发和应用。性信息素结合蛋白(PBPs)在鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾性信息素识别过程中起重要作用。本研究从草地贪夜蛾中克隆了4个编码PBPs的cDNA序列,命名为SfruPBP1-SfruPBP4。4个SfruPBP s均含有完整的开放阅读框,所编码的蛋白具有性信息素结合蛋白的典型特征:N-端有信号肽、具有保守的6个半胱氨酸残基。系统进化分析显示SfruPBPs与斜纹夜蛾和海灰翅夜蛾PBPs的亲缘关系最近,且4个SfruPBPs被聚在不同的进化分支。4个SfruPBP s基因均由3个外显子和2个内含子组成,内含子插入位点高度保守。此外,4个SfruPBP s在草地贪夜蛾基因组上呈串联排列。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在成虫触角中特异性表达,其中SfruPBP1和SfruPBP2在雄成虫触角中的表达水平显著高于雌虫,而SfruPBP3在雌雄触角中的表达水平无显著差异。SfruPBP4特异性表达于雄成虫腹部。本研究结果为揭示草地贪夜蛾性信息素识别机制奠定了基础。

棉红铃虫信息素结合蛋白的同源模建

用同源模建的方法构建了棉红铃虫Pectinophora gossypiella信息素结合蛋白。Procheck、Verify_3D、Errat、ProSa2003等程序的评价结果表明模建结构是可靠的。模建结构显示棉红铃虫的信息素结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形。6个保守的半胱氨酸形成三个对结构起稳定作用的二硫键。

荔枝蒂蛀虫信息素结合蛋白基因序列及表达分析

【目的】获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis 3个信息素结合蛋白(PBP)基因的全长序列,并分析序列和表达特征,为更好地利用性信息素防治该虫提供必要的基础。【方法】提取荔枝蒂蛀虫触角总RNA,利用转录组测序结果和RACE-PCR技术获得3个PBP基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用I-TASSER在线软件建立蛋白三维模型,用TM-align软件进行同源建模,用COACH软件推测蛋白的结合位点;用荧光定量PCR方法分析这3个基因在不同龄期(幼虫和蛹)和3日龄雌雄成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅]中的表达谱。【结果】从荔枝蒂蛀虫触角中克隆了3个PBP基因的全长序列,分别命名为Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3(Gen Bank登录号:MF093145,MF093146和MF093147)。序列分析结果表明,这3个基因的编码蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,并且Csin PBP1与紫色卷蛾Yponomeuta cagnagellus PBP的氨基酸序列一致性达72%,Csin PBP2与小菜蛾Plutella xylostella PBP1的氨基酸序列一致性达55%,Csin PBP3与水稻大螟Sesamia inferens PBP3的氨基酸序列一致性达39%。软件模拟分析表明,Csin PBP1,Csin PBP2和Csin PBP3蛋白的三维结构分别与家蚕Bombyx mori普通气味结合蛋白2(GOBP2)(PDB:2wc6A)、脐橙螟Amyetois transitetella PBP1(PDB:4inx A)和家蚕PBP(PDB:2p70A)相似度最高,分别预测得到10,7和8个结合位点。表达谱分析显示,3个基因均只在成虫触角中表达,在幼虫期和蛹期不表达,在成虫头(去除触角)、胸、腹、足和翅中也不表达,且在雄虫触角中的表达量分别是雌虫中表达量的1.94,28.19和32.94倍。【结论】获得荔枝蒂蛀虫3个PBP基因的全长序列,序列和表达分析结果提示这3个基因与雄虫感受性信息素有关。

野桑蚕性信息素结合蛋白(PBP)亚家族基因的克隆与进化分析

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。分析野桑蚕和家蚕pbp基因的编码区,发现碱基突变主要以转换为主(14/18),氨基酸变异主要为同义突变(16/18),成熟蛋白质的理化性质变化小,二级结构无变化,推测野桑蚕向家蚕的进化过程中PBP亚家族的基因功能没有变化。对具有PBP亚家族3个已知基因的6个昆虫物种进行氨基酸遗传距离和同源性分析,结果表明野桑蚕和家蚕间PBP1、PBP2、PBP3的遗传距离分别为0、0.02、0,同源性分别高达100%、98.6%和100%,物种间基因的进化速率很慢,进化分析显示PBP亚家族在这几个物种分化前已经产生。

斜纹夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))雄蛾触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的信息素结合蛋白(PBP)cDNA片段:SlitPBP1和SlitPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成,并且具有5个保守的半胱氨酸位点(全序列应有6个)。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种夜蛾科昆虫的PBP氨基酸序列具较高的同源性。

用同源模建方法预测蔷薇科斜条卷叶蛾信息素结合蛋白的三维结构

[目的]预测蔷薇科斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)信息素结合蛋白的三维结构。[方法]用同源模建的方法构建蔷薇科斜条卷叶蛾信息素结合蛋白的三维结构,并分别用Procheck、Verify_3D、Errat、ProSa2003等程序对模建结构的可靠性进行评价。[结果]模建结构显示蔷薇科斜条卷叶蛾的信息素结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形的特征,6个保守的半胱氨酸形成3个对结构起稳定作用的二硫键。[结论]预测结构可靠,为蔷薇科斜条卷叶蛾的研究及虫害的防治奠定了理论基础。

昆虫信息素结合蛋白研究进展

昆虫信息素结合蛋白是气味结合蛋白家族的一种,在昆虫识别性信息素过程中起非常重要的作用。本文简述了信息素结合蛋白的特征、信息素分子结合及释放机制、表达时间和生理功能等,并概述了目前信息素蛋白的研究情况。

野桑蚕性信息素结合蛋白基因pbp1、气味受体基因or1和or3的克隆及其与家蚕同源基因的进化分析

昆虫能够特异性识别同类异性。雄蚕蛾对雌蚕蛾感知定位过程中,性信息素结合蛋白PBP1、气味受体OR1和OR3起重要作用。为研究家蚕Bombyx mori和野桑蚕Bombyx mandarina杂交困难的分子机制,了解性识别相关基因的进化,本研究克隆得到了野桑蚕的性信息素结合蛋白基因pbp1(GenBank注册号:GQ246497)和气味受体基因or1(Genank注册号:GQ246496)和or3(GenBank注册号:GQ246498)。序列分析发现,家蚕与野桑蚕相比,pbp1基因存在4个SNP位点,分别为C10A,A40T,T270C和A333G,其中2个SNP位点引起氨基酸的改变,分别为Q→K和N→Y;or1基因存在5个SNP位点,分别为T910C,A1147C,A1192T,T1276C和G1282A,其中1个SNP位点引起氨基酸F→L的改变;or3基因存在4个SNP位点,分别为A507G,A513G,T605C和G672A,其中1个SNP位点引起氨基酸I→T的改变。3个基因的遗传距离很近,进化速率也很慢。氨基酸的分子量和等电点有细微差异或无差异。PHD预测的二级结构表明,变异位点对附近区域的结构没有任何影响,功能位点也没有变化。推测家蚕与野桑蚕之间,这些基因功能可能没有差异,即二者的雌雄性个体间可以相互感知、识别,这与实验观察结果一致。

基于同源模建方法对玉米夜蛾信息素结合蛋白三维结构的预测与分析

玉米夜蛾食性杂,危害作物多,分布范围广。该研究用同源模建的方法构建了玉米夜蛾信息素结合蛋白的三维结构。Procheck、Verify 3D、Errat、ProSa2003等程序的评价结果表明模建结构是可靠的。模建结构显示玉米夜蛾的信息素结合蛋白由6个α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,底物结合口袋成锥形。6个保守的半胱氨酸形成3个对结构起稳定作用的二硫键。

桃蛀螟性信息素结合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表达谱及其与配体化合物的结合特性分析

【目的】为了更好地了解性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis(Guenée)嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合特性。【方法】本研究利用RT-PCR结合RACE方法克隆了桃蛀螟一个性信息素结合蛋白基因;采用Real-time PCR方法分析了该蛋白在桃蛀螟不同发育阶段及雌雄蛾间的表达差异;利用荧光竞争结合实验对Cpun-PBP1蛋白与16种配基化合物的结合特性进行了分析。【结果】克隆了一个桃蛀螟性信息素结合蛋白基因,命名为Cpun-PBP1(Gen Bank登录号:KP027486)。Cpun-PBP1开放阅读框全长510 bp,编码169个氨基酸,预测分子量为19.12 k Da,等电点为5.09,N-末端包括由起始位置开始的30个氨基酸组成的信号肽。蛋白特征分析显示,该氨基酸序列具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。Cpun-PBP1在桃蛀螟成虫阶段表达量最高,且几乎全部在触角中表达,卵期微量表达,幼虫期和蛹期均不表达。通过构建Cpun-PBP1原核表达载体,诱导并获得Cpun-PBP1重组蛋白。荧光竞争结合实验对2种性信息素组分和14种寄主植物挥发物的结合力发现,Cpun-PBP1不但能有效地与桃蛀螟性信息素组分(顺-10-十六碳烯醛和十六醛)结合,结合常数分别为7.32和9.39μmol/L;还能与8种寄主植物挥发物有效结合;其中,与莰烯的结合能力最强,结合常数为3.76μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测Cpun-PBP1在桃蛀螟感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中发挥着双重作用。

中华蜜蜂性信息素结合蛋白ASP1的原核表达及配基结合特性分析

【目的】研究中华蜜蜂Apis cerana cerana信息素结合蛋白ASP1与蜜蜂信息素及某些植物挥发物分子的结合功能。【方法】构建中蜂ASP1的原核表达载体,对其进行重组蛋白的诱导表达和分离纯化,并得到具有生化活性的中蜂ASP1重组蛋白,最后以1-NPN作为荧光报告探针,通过荧光竞争结合实验研究中蜂重组ASP1蛋白与蜜蜂信息素及其他气味分子的结合功能。【结果】在22种潜在信息气味物质中,有7种与中蜂ASP1有较强的结合能力,能将1-NPN的相对荧光强度降至50%以下。其中发现蜂王信息素两种成分对-羟基苯甲酸甲酯和香草醇的竞争能力最强,可分别引起1-NPN相对荧光值下降99.31%和95.50%,解离常数K D分别为13.39和98.44μmol/L;而与除蜂王信息素外的其他信息素如幼虫信息素和工蜂信息素等分子均不结合。此外中蜂ASP1对于水杨酸甲酯、苯乙醛、3,4-二甲基苯甲醛4-烯丙基藜芦醚和β-紫罗兰酮等5种植物挥发物质能产生强度不一的结合。【结论】中蜂信息素结合蛋白ASP1对蜂王信息素具有非常强的特异性,同时也能结合某些植物挥发性气味分子,暗示中蜂ASP1是一种以蜂王信息素识别为主要功能、植物挥发物识别为次要功能的多功能信息素结合蛋白。