CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。

肽图法对细胞色素C中铂修饰位点研究

生物体系电子转移反应的研究是当今生物无机化学的一个热点,许多重要的生命过程如光合作用、呼吸链氧化磷酸化等均涉及电子转移。电子转移反应速率受驱动力、电子给体与受体之间的距离以及传递介质等因素的影响。

小鼠SP2/0细胞移植瘤的遗传修饰位点

背景与目的:我们的研究发现BALB/c小鼠是SP2/0细胞移植瘤的敏感小鼠,而C57BL/6J小鼠则是抗性小鼠。本研究利用这两种近交系小鼠和它们杂交的F2代进行移植肿瘤重量遗传修饰位点的检测。方法:对208只BALB/c×C57BL/6J的F2代小鼠左后腿皮下注射5.0×106个SP2/0细胞,在注射后第17天处死小鼠,记录移植瘤的数量和重量。采用覆盖小鼠所有染色体的85个微卫星标记,对208只F2代小鼠进行全基因组扫描,并进行复合区间作图。结果:发现8个变异解释率>10%的位点与肿瘤生长有关(P<0.01),它们分别位于1号(D1Mit113,55cM和D1Mit407,52cM)、4号(D4Mit226,41cM)、9号(D9Mit302,55cM)、10号(D10Mit264,42cM)、11号(D11Mit115,35cM)、14号(D14Mit125,45cM)和18号染色体(D18Mit123,31cM)上。结论:个体对SP2/0细胞移植瘤的易感性受多位点变异控制,找到目标位点有助于基因单倍型确认和肿瘤易感性/抗性基因的精细研究。

慢性哮喘小鼠肺组织中组蛋白乙酰化修饰位点H2BK16ac表达增强

目的探讨组蛋白乙酰化修饰位点H2BK16a在慢性哮喘模型小鼠肺组织中的表达变化。方法BALB/C小鼠分为正常组和慢性哮喘组,应用卵蛋白致敏和激发方法构建慢性哮喘模型,HE染色观察气道炎症浸润,AB-PAS染色观察气道杯状细胞增生,Masson染色观察上皮下胶原沉积,免疫组织化学染色观察H2BK16ac在肺组织中的表达分布,Western blot检测肺组织中H2BK16ac水平。结果慢性哮喘小鼠气道血管周围可见大量炎症细胞浸润、气道纤毛柱状上皮细胞中的杯状细胞增生、黏液腺化生、上皮下胶原沉积,表明构建慢性哮喘模型成功。免疫组织化学染色和Western blot检测显示,正常小鼠肺组织中H2BK16ac的表达极少;慢性哮喘小鼠肺组织中H2BK16ac的表达水平显著升高,在气道纤毛柱状上皮细胞、气道血管周围炎症细胞、血管平滑肌细胞、肺泡腔炎症细胞中H2BK16ac均呈明显阳性表达。结论肺组织中乙酰化修饰位点H2BK16ac的高表达可能与慢性哮喘的发生密切相关。

成骨细胞骨涎蛋白成熟肽修饰位点和进化踪迹分析

目的探讨成骨细胞中骨涎蛋白(BSP)的表达以及进化踪迹,并对成熟肽基因行序列分析,获得BSP修饰位点。方法体外培养成骨细胞,提取成骨细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增BSP成熟肽基因并克隆到p Bluescript KS载体,筛选阳性克隆进行序列测定。以成骨细胞的骨涎蛋白为种子序列,利用多种生物信息学工具进行细胞的骨涎蛋白的序列查找及其同源蛋白的搜索,并以此为基础对骨涎蛋白的进化踪迹位点及相关的功能位点进行比较研究。结果共得到具有完整结构域的同源蛋白序列72条,骨涎蛋白家族的BSP-前肽结构域具16个全家族保守残基,以及10个RGD结合域和BSP结构域的33个亚家族特异性残基。骨涎蛋RGD结构域的配基结合位点主要分布于结合口袋的中间区域。PCR扩增到一特异性的900bp片段,克隆后筛选出阳性克隆进行序列分析,测定结果与数据库的序列基本相同。结论成骨细胞中能表达并翻译为有活性的BSP,BSP成熟肽存在甲基和乙酰化修饰位点。

基于LightGBM的蛋白质类泛素化修饰位点预测

蛋白质类泛素化修饰位点的准确识别对基础研究和药物开发都具有重要意义。该文提出了一种基于蛋白质序列特征的类泛素化修饰位点预测模型。该模型结合氨基酸的物理化学属性统计特征和氨基酸序列二元语法模式特征,训练一种轻量型梯度提升机(Light gradient boosting machine,LightGBM)分类器预测某个蛋白质序列的类泛素化修饰位点。该文对比了不同特征的鉴别性,以及不同分类模型的预测性能。在基准数据集上的试验结果证明了该文所提方法的有效性,相比于现有方法在性能上取得了明显的提升,马修斯相关系数为91.64%。

官能团及修饰位点对金属有机骨架化合物（MOFs）CO2/CH4分离性能的影响:蒙特卡洛模拟研究（英文）

本文采用巨正则蒙特卡罗（GCMC）模拟，研究金属有机骨架中官能团修饰的种类及位点对垃圾填埋气（CO2／CH4）吸附分离性能的影响．选用六种不同有机配体，分别组成六种铜基pcu构型MOFs，并采用三种官能团（-F、-NH2、-CH3）对其有机配体上距金属团簇不同距离的位点进行修饰，获得36种MOFs结构，并对它们在低压真空变压吸附（VsA）和高压变压吸附（PSA）的C02／CH4分离性能进行模拟．结果表明，在低压下，未修饰MOFs的CO2吸附量呈现出随孔径增大而减小的趋势．三种官能团中，-NH2修饰的MOFs因其强库伦相互作用而具有最优的C02吸附性能，其次，具有强范德华相互作用的MOF—CH3，而-F具有吸电子效应，且其作为单原子官能团的弱范德华相互作用使得它的C02吸附性能略逊于未修饰MOFs．此外，将官能团修饰于距金属团簇较远的位点（位点b）时，所造成的影响比修饰于近位点（位点a）更明显．

YPEG-rhIFN-α_(2a)修饰位点结构解析

目的对Y型PEG化重组人干扰素α_(2a)的PEG修饰位点进行了相关研究。方法首先采用HPLC SP方法对YPEG-rhIFN-α_(2a)的不同修饰位点组分进行分离;然后用TPCK胰酶酶切rhIFN-α_(2a)和YPEG-rhIFN-α_(2a),通过HPLC-RPC法分离酶切肽段,进而用质谱法(MALDI-TOF MS)解析rhIFN-α_(2a)肽段,获得rhIFN-α_(2a)完整的TPCK胰酶肽图信息;最后对比分析rhIFN-α_(2a)和YPEG-rhIFN-α_(2a)的HPLC-RPC TPCK胰酶肽图,结合N-端氨基酸序列测定法测定PEG肽段的氨基酸序列,确认YPEG-rhIFN-α_(2a)的PEG修饰位点。结果及结论结果表明,YPEG-rhIFN-α_(2a)的PEG修饰位点主要为Lys134和Lys31。

基于XGBoost的RNA修饰位点的识别

为了实现用一种方法更准确地识别几种不同类型的RNA修饰位点,提出了一种融合位置特异性单核苷酸及双核苷酸偏好特征的k-元组核苷酸组成(PseKNC)编码方式,并构建了一个基于XGBoost的RNA修饰位点的预测模型。通过交叉验证测试表明,该模型的识别准确率优于现有模型。

复杂运动情境下AMPK的多位点修饰及其活性调节——基于蛋白质结构生物学的解析

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)以异源三聚体的形式广泛存在于真核生物体内,被认为是细胞的能量感受器和机体的核心代谢调节因子。运动与AMPK的相关研究已持续数十年,研究发现:1)急性运动迅速激活AMPK;2)长期训练提升安静状态AMPK的活性;3)长期训练减弱AMPK对运动的应激反应。这表明AMPK对研究中设置的运动情境很敏感。AMPK的蛋白结构包含多个磷酸化位点,以及泛素化、SUMO化、乙酰化、甲基化和氧化位点,这些位点的共价修饰大部分是可逆和可组合的。通过结构生物学的解析可以预测,AMPK蛋白复合物并非只有简单的激活态与失活态,α-Thr172磷酸化不一定是AMPK酶活性的生物标记。多个位点的翻译后修饰以及变构调节,让AMPK亚基可能组合成不同中间状态,蛋白结构的柔性让AMPK能够以不同活性形态应对复杂的生理情境(包括复杂的运动情境)。未来的研究可以探讨多位点修饰与AMPK活性之间的对应关系,从而进一步解析AMPK对运动的响应机制。

液相肽图法推断聚乙二醇化重组人生长激素的聚乙二醇修饰位点研究

目的利用液相肽图法对聚乙二醇(PEG)化重组人生长激素(rhGC)(PEG-rhGH)的聚乙二醇修饰位点进行测定。方法通过优化酶切条件,建立肽段分离度高、信息完整的液相肽图方法。继而通过引入高分辨率质谱,对重组人生长激素的液相肽图准确定性。最后通过比较发生改变的修饰前后的肽段,推断聚乙二醇的修饰位点。结果 3个厂家的聚乙二醇化重组人生长激素中发生较为明显修饰的肽段有5个,分别为T1(N-end)、T4(lys38)、T13(lys140)、T14(lys145)及T15(lys158)。结论液相肽图法可用于对结构复杂、不均一性较高的多位点异构体聚乙二醇修饰药物的位点测定。

孕烯醇酮D环结构修饰的合成方法及生物活性研究进展

简单介绍了甾体的结构以及在医药方面的广泛应用;阐述了16-脱氢孕烯醇酮醋酸酯(16-DPA)作为合成甾体药物的关键中间体在甾体合成中占有重要地位;随后详细综述了以不同基团修饰16-DPA的D环得到甾体衍生物的合成方法,其中包括N杂环(噁唑环、吡唑环、嘧啶环、咪唑环)、O杂环、碳环等修饰;以及其显示的抗肿瘤抗炎等生物活性进行分析;最后进行总结并对其发展趋势和应用前景进行了展望。

聚乙二醇化重组人干扰素α2b位置异构体比例离子交换高效液相色谱测定法的建立及修饰位点分析

目的建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEGylated recombinant human interferonα2b,PEG-rhIFNα2b)位置异构体比例的离子交换高效液相色谱(ion exchange high performance liquid chromatography,IEC-HPLC)测定法,并对各异构体修饰位点进行分析。方法色谱柱采用Proteomix SCX-NP10(10.0 mm×250 mm,10μm);流动相A为:1.8 mmol/L一水合柠檬酸-3.3 mmol/L十二水合磷酸氢二钠(pH 5.3),流动相B为:30 mmol/L柠檬酸三钠-35 mmol/L二水合磷酸二氢钠(pH 6.0);线性梯度洗脱:0~180 min(0%B→12%B),180~220 min(12%B→15%B);流速为:0.4 mL/min;柱温为:25℃;进样量:不低于100μg。同时对IEC-HPLC法进行专属性及重复性验证。采用建立的方法测定3批PEG-rhIFNα2b的位置异构体比例,并通过SPSS 19.0软件进行分析,拟定5个位置异构体比例质量标准。采用建立的方法富集5个位置异构体的洗脱峰,进行修饰位点定位。结果空白对照和rhIFNα2b原液无色谱峰出现,对PEG-rhIFNα2b位置异构体测定无干扰,PEG-rhIFNα2b可见5个异构体峰,且分离度良好;同批PEG-rhIFNα2b连续测定3 d,峰1、2、3、4和5面积的总RSD分别为1.96%、2.53%、2.54%、1.05%和1.86%,均<3.0%。PEG-rhIFNα2b的5个位置异构体比例质量标准可拟定为:峰1为5%~9%、峰2为14%~21%、峰3为7%~10%、峰4为30%~34%、峰5为31%~39%。PEG-rhIFNα2b位置异构体峰1修饰位点主要为K31,峰2主要为K134,峰3主要为K131和K164,峰4主要为K83,峰5主要为K121,未检测到N-末端PEG修饰。结论建立了PEG-rhIFNα2b位置异构体比例的IEC-HPLC测定法,该方法具有良好的专属性及重复性,可用于PEG-rhIFNα2b位置异构体比例的测定。

黑腹果蝇保幼激素受体Met泛素化修饰位点预测及功能验证

目的预测黑腹果蝇保幼激素(juvenile hormone,JH)受体Methoprene tolerant(Met)的泛素化修饰位点,并验证其功能。方法利用UbPred和CKSAAP_UbSite在线预测工具对Met的泛素化位点进行预测;通过重叠PCR技术将预测的各泛素化修饰位点赖氨酸分别突变为丙氨酸,同时将第46和526位赖氨酸突变为丙氨酸;将突变后的Met插入至表达载体p Ac5. 1/V5-His B中,构建各位点突变的表达质粒;转染果蝇Kc细胞,并经格尔德霉素(geldanamycin,GA)处理,Western blot法检测各位点突变后Met的表达。结果根据UbPred和CKSAAP_UbSite在线网站预测结果,选取7个赖氨酸位点作为Met的潜在泛素化修饰位点,CKSAAP_UbSite及UbPred预测分值最高的分别为第46和526位赖氨酸。构建的Met各位点突变表达质粒转染果蝇Kc细胞后,于相对分子质量约82 000处均可见Met目的蛋白的表达,经GA处理后,Met表达下降。结论成功构建了Met的7个预测泛素化修饰位点的单突变表达质粒及1个双突变表达质粒,这些位点的突变均不足以抑制GA诱导Met的降解。

多位点硝基取代四苯基卟啉的合成及光谱研究

将硝基修饰于四苯基卟啉meso位苯环的邻、间、对位上,合成了三个化合物o-TNPP、m-TNPP及p-TNPP。考察了不同取代位点的硝基对卟吩环上电子云密度分布的影响。通过溶剂化效应、AIE效应、pH效应、循环伏安曲线测试表明,o-TNPP、p-TNPP的卟吩环内电子云密度减小,共轭增强,表现出ACQ性质。m-TNPP的meso位苯环上电子云呈螺旋桨式分布于硝基外围,使卟啉发生空间扭曲,共轭削弱,表现出AIE性质。

清蛋白作为药物载体的PEG化修饰研究进展

清蛋白(白蛋白)是一种理想的药物载体,但由于其在体内半衰期短以及易被酶降解等缺点限制了其应用,然而根据其具有多个修饰位点的结构特点,可通过PEG修饰延长循环时间,阻碍酶的作用等。目前,PEG修饰清蛋白仍处于研究阶段,已有较多关于PEG修饰清蛋白的研究,例如PEG修饰所起的作用、对清蛋白及其制剂的影响,以及修饰位点的选择等。本文对清蛋白的PEG化修饰的相关研究进行综述。

使用合成的无修饰RNA文库对超转录组图谱进行系统校准

据张璋2021年9月30日[Nat Methods,2021,18(10):1213-1222.]报道,中山大学生命科学学院骆观正教授团队通过构建全转录组无修饰RNA文库作为负对照,全面评估了现有基于二代测序的RNA修饰检测技术,并为修饰位点的精确鉴定提供系统的解决方案。真核生物不同种类RNA上存在超过150种不同的化学修饰,其中很大部分继承于古老的共同祖先。这些修饰或参与了RNA与其他大分子的相互作用,或影响了RNA本身的代谢,在生命过程中起着至关重要的作用。准确且定量地鉴定RNA修饰位点及其修饰比例,是深入了解RNA修饰的分布、功能及其背后的机制的前提。

p53蛋白的结构与功能及磷酸化修饰的生物学效应研究概述

p53是一个重要的抑癌基因,其表达产物在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。本文概述p53蛋白的结构与功能,以及磷酸化修饰的生物学效应。

超声波预处理对小清蛋白半乳糖糖基化特性的影响

糖基化是美拉德反应的初始阶段,在食品加工与贮藏中有着重要的作用。本实验采用超声波对鲢鱼小清蛋白进行预处理,随后将其与半乳糖进行糖基化反应,采用高效液相色谱联合尺寸排阻色谱,内源荧光、紫外吸收、同步荧光光谱以及高分辨质谱等技术对糖基化小清蛋白的多级结构、糖基化程度以及糖基化肽段和位点进行表征,探究超声波预处理对小清蛋白半乳糖糖基化特性的影响。结果表明:糖基化可明显增加小清蛋白分子质量,降低其游离氨基质量浓度、内源荧光及紫外吸收强度,并改变小清蛋白的三级结构,而超声波预处理进一步促进了这些变化。未经超声波处理的糖基化小清蛋白含有4个糖基化修饰位点(K46、K55、K65和K88),而超声波预处理结合糖基化后的小清蛋白糖基化修饰位点增加至6个(K46、K55、K65、K88、K97和K108)。综上,超声波预处理使蛋白质的结构展开,增加糖基化反应程度,改善蛋白质糖基化特性。

糖基化联合磷酸化降低鲢鱼小清蛋白致敏性的机制

以鲢鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)为研究对象,采用糖基化联合磷酸化对其进行修饰,运用光谱、质谱和KU812细胞实验等方法研究修饰后鲢鱼PV抗原表位和致敏性的变化。结果表明:糖基化联合磷酸化修饰可增加鲢鱼PV分子质量,降低游离氨基含量,且改变其二级结构和构象结构;糖基化联合磷酸化修饰后的鲢鱼PV含有8个糖基化位点(K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108)和1个磷酸化位点(S56)。糖基化联合磷酸化修饰能显著降低鲢鱼PV与IgG/IgE的结合能力,也能降低KU812细胞中组胺和白介素-6的释放能力。因此,糖基化联合磷酸化修饰通过糖基化和磷酸化位点遮掩鲢鱼PV的线性表位和破坏其构象表位,降低其致敏性。研究结果为开发低致敏性鱼类制品提供重要的理论依据。