猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1对猪的安全性研究

为探究猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1(将牛病毒性腹泻病毒1型E^(rns)和猪瘟病毒基因2型流行株E2高变区分别置换弱毒疫苗C株对应区域构建而成)对猪的安全性,本实验以2.0×10^(5)FAID_(50)(50%荧光抗体感染剂量)高剂量的RecC-M1株经颈部肌肉注射接种12头35日龄猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性仔猪,另设生理盐水对照组6头。接种后观察各组猪的临床症状,并于接种后不同时间(0、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d和42 d)采血用于细胞计数;接种后7 d和42 d各取6头猪(包括第42 d对照组6头猪),剖杀后观察各组织剖检病变,并取各组织制作切片观察组织病变,采用qPCR检测病毒在各组猪各组织中的分布。根据qPCR结果,选择阳性组织样品(扁桃体、肾脏和淋巴结)的病理切片采用免疫组化法检测RecC-M1株在猪上述各组织中的分布。于接种后0~7 d、14 d、28 d和42 d分别采集各组猪的鼻拭子和肛拭子样品以及不同时间采集的血液,均采用qPCR检测各组猪的病毒血症及排毒;采用间接ELISA分别检测各组猪血清中分别针对BVDV及CSFV相应抗原的抗体水平。结果显示,RecC-M1组猪在42 d的观察期内均未出现临床症状,体温、白细胞数和淋巴细胞数与阴性对照组猪均无明显差异,且均在正常范围内;剖检及组织病变观察结果显示,接种后7 d和42 d猪的各组织均未见淤血或出血;扁桃体、淋巴结、脾、肾、膀胱、回盲瓣等CSFV嗜性组织均未见明显的病理学变化;各组织样品的qPCR结果显示,接种后7 d所有6头猪的肾脏和扁桃体样品和2头猪的淋巴结样品中均检出CSFV核酸,而接种后42 d所有猪的组织样品均为阴性;免疫组化结果显示,接种后7 d猪扁桃体和肾脏样品中CSFV抗原均呈阳性,接种后42 d猪的所有组织样品则均转为阴性;病毒血症和排毒的qPCR结果显示,接种后14 d内部分猪血液、鼻拭子和肛拭子样品中检出CSFV核酸,接种后28 d和42 d所有猪血液、鼻拭子和肛拭子则均为阴性。间接ELISA结果显示,接种后14 d针对BVDV1 E^(rns)抗体开始上升,而针对CSFV E2的抗体则在接种后7 d开始上升,此后两种抗体水平均随时间的推移呈持续上升趋势。阴性对照组猪各组织均未见明显剖检及组织病变,各组织CSFV抗原,各组织、血液及拭子样品均为阴性,也未产生针对相应病毒抗原的抗体。上述结果表明,高剂量的RecC-M1株对猪是安全的,本研究为RecC-M1株作为猪瘟弱毒标记疫苗的产业化开发奠定实验基础。

基于荧光定量PCR法的鸡传染性支气管炎疫苗免疫效果评价研究

采用鸡胚传代致弱法得到一株可用于鸡传染性支气管炎疫苗的候选毒株,同时设定一个商品疫苗作为对照,采用荧光定量PCR法评价疫苗的免疫效果。结果表明,攻毒后7 d,两组试验鸡多数脏器均能检测到弱毒,部分脏器检测不到强毒,说明致弱毒株候选疫苗和商品疫苗对试验鸡有很好的保护作用。

鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)的致病性

目的评价鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)的致病性。方法采用鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZΔspi C[1×10~7、1×10~9 CFU/(0. 1 mL·只)]及鸡白痢沙门菌S06004(Nal^R)[1×10~7 CFU/(0. 1 mL·只)],分别经肌肉注射和口服感染小鼠,同时设空白对照组(未感染)。观察小鼠的临床症状、病理、体重、脏器内菌体载量、粪便排菌及脾脏细胞因子水平,分析鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株对小鼠的致病性。结果与空白对照组比较,各组小鼠均未出现任何临床症状,肝脏、脾脏、盲肠病理观察均未见任何病变,体重变化差异无统计学意义(P> 0. 05)。与鸡白痢沙门菌S06004(Nal R)感染组比较,减毒活疫苗候选株感染组小鼠肝脏、脾脏、盲肠内及小鼠粪便载菌量均降低。各感染组小鼠脾脏中炎性因子IL-1β、IFNγ、IL-12、IL-6表达量均较低,仅引起小鼠轻微短暂的炎症反应。结论鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株SKLZΔspiC对非靶动物(鼠)无致病性,符合公共卫生安全要求。

A型流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒生物学性状的初步研究

为明确E61-24-P15 A型重组流感病毒的第189代传代子病毒(IVpi-189)是否具备流感病毒温度敏感减毒活疫苗候选株的特点,将IVpi-189病毒感染MDCK细胞,并于不同培养温度条件下培养,观察其致细胞病变效应,病毒合成、释放情况,以及不同温度条件下病毒存活时间。结果显示32℃培养温度下,IVpi-189病毒具有等同于亲代野生病毒株的诱导细胞病变能力,而当培养温度上调至38℃,IVpi-189病毒致细胞病变效果出现缓慢且程度明显减轻。空斑形成单位实验发现IVpi-189病毒在38℃培养条件下增殖能力明显下降,其原因与病毒灭活速度及子病毒释放无关,但与感染细胞病毒合成能力下降有关。上述实验结果初步证实流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒具有温度敏感减毒活疫苗的生物学特性,在许可培养温度条件下具有良好的增殖能力,而在非许可培养温度下,病毒增殖活性受到明显抑制。本研究为流感病毒减毒活疫苗的开发研制提供实验佐证。

B型流感病毒血凝素的表达及免疫原性测定

B型流感病毒是引起季节性流感的原因之一,严重时会造成重大疾病或死亡。为了检测B型流感病毒2个疫苗候选毒株的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段在哺乳动物细胞中的表达及在小鼠体内的免疫原性,本研究将带有三聚体标签的HA胞外段(HA-ectodomain,HA-ecto)序列及神经氨酸酶(neuraminidase,NA)全长编码框经密码子优化后构建至pCAGGS载体中,通过线性聚乙烯亚胺将pCAGGS-HA-ecto与pCAGGS-NA共转染293T细胞。收集转染后96h的上清,通过镍离子亲和层析及分子筛层析获得三聚体形式的HA-ecto蛋白,然后将HA-ecto三聚体蛋白免疫小鼠,进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HAI)检测HA-ecto蛋白诱导小鼠后产生的抗体水平。纯化结果显示,通过哺乳动物细胞表达系统能够得到分泌型表达的三聚体HA-ecto蛋白。ELISA及HAI结果显示,三聚体HA-ecto蛋白二次免疫小鼠后,能诱导小鼠产生较高水平的同源和异源交叉抗体。以上结果表明,哺乳动物细胞表达的B型流感病毒HA蛋白可作为亚单位重组流感疫苗的候选。