Mn^(2+)驱动的不同长度DNA片段PCR随机突变研究

针对倾向错误的PCR技术中不同目的、不同长度基因的诱变种类一直缺乏准确参考的问题,以酵母spt15基因为研究对象,在标准的PCR反应体系中加入不同Mn2+摩尔浓度(0.125,0.250和0.500mmol.L-1)进行倾向错误的PCR,扩增spt15不同长度(分别约为200,500和700bp)的DNA片段,研究其突变频率,突变碱基数目及突变类型,以分析不同种类的突变所需的最佳条件.研究结果表明:长片段DNA的PCR突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感;模板的长度对DNA PCR突变碱基个数也有较为明显的影响,低Mn2+摩尔浓度有利于单突变;Mn2+驱动的突变有明显的倾向性,其中A→G和T→C的突变居多.

草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR(error-prone PCR)突变技术,以可变盐单胞菌(Halomonas variabilis)HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段(约1·35kb).将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.

蛋白质定向进化的研究进展及其应用前景

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。它不需要了解蛋白质的空间结构,主要通过在实验室里模拟自然进化过程,采用错误倾向PCR等方法对编码蛋白质的基因进行随机突变,经DNA改组、交错延伸等技术进行体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变体。本文综述了定向进化技术的发展及应用。

用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术

蛋白质体外分子进化是模拟自然的进化过程，利用基因随机突变和定向筛选（选择）技术，以获得具有预期新功能的突变体分子。虽然体外进化近几年才产生，但已成为医药和工业领域中筛选具有特殊催化性质的酶的最重要的方法之一。ＤＮＡ随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础，本文将对几种最重要的突变方法：倾向错误的ＰＣＲ、ＤＮＡ重排、模板交错延伸反应和随机延伸突变的原理和应用等加以介绍。

DNA改组的最新动态及应用前景

DNA改组(DNA shuffling)是目前最方便、有效的一种分子水平的体外定向进化技术,该技术同倾向错误PCR(Error-prone PCR)相结合,通过对单基因或相关基因家族的靶序列进行多轮随机诱变、重组和高通量的筛选,可以有效富集正突变,去除负突变,提高突变文库的丰度,创造新基因和获得期望功能的蛋白质。DNA改组技术已在新药物等领域取得了广泛的应用,极大地推动了现代生物科学和生物技术的发展。该技术同计算机强大的数据分析系统相结合,将会为后基因组学的发展提供强有力的技术平台。