磁性壳聚糖纳米复合材料固定化褶皱假丝酵母脂肪酶催化合成木质甾醇酯

以磁性壳聚糖纳米复合材料共价固定的褶皱假丝酵母脂肪酶为催化剂,以木质甾醇和油酸为原料,对木质甾醇油酸酯的酶法合成工艺条件进行了优化。得到的最佳工艺条件为:催化剂用量12.7%(以底物总质量计),油酸与木质甾醇物质的量比为2∶1,木质甾醇质量浓度为122.9 g/L,反应温度50℃,反应时间24 h。在该条件下,木质甾醇转化率为96.42%。对月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸不同碳链长度的脂肪酸或混合脂肪酸进行酯化反应,木质甾醇的转化率可达96.67%~98.74%,催化剂使用5次时,转化率仍可达82.45%。

南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其催化己酸乙酯的合成

从南极假丝酵母(Candida antarctica)基因组克隆得到南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B,CALB)全基因片段,利用连接肽celA Linker将CALB与酿酒酵母细胞表面展示蛋白α-凝集素的C端连接融合,构建表面展示载体pICAS-celAL-CALB,转化酵母后获得重组酵母菌Saccharomyces cerevisiae pICAS-celAL-CALB。该重组酵母菌经葡萄糖诱导表达及分析,表明CALB已在酿酒酵母细胞表面成功展示,水解活力达26.26 u/(g·dry cell)。重组酵母菌经冻干能有效地实现在非水相中全细胞催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯。反应物己酸与乙醇的摩尔比为1:1.25,己酸乙酯的产率为98.0%,具有较好的操作稳定性。

AOT/Triton X-100混合反胶束体系中假丝酵母脂肪酶催化蓖麻油水解的活性

研究了二(2-乙基己基)琥珀酸磺酸钠(AOT)/Triton X-100混合反胶束体系中假丝酵母脂肪酶(candida rugosa lipase)催化蓖麻油水解的反应.考察了Triton X-100占总表面活性剂的摩尔分数(x(Triton X-100))、水与总体表面活性剂的摩尔比(ω_0)、pH值、反应温度以及底物蓖麻油的浓度等因素对酶活性的影响.研究结果表明,加入非离子表面活性剂Triton X-100可以使假丝酵母脂肪酶的活性得到显著提高,但是当底物蓖麻油的浓度大于0.24 mol·L^(-1)时,会对假丝酵母脂肪酶产生抑制作用.

酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的一般酶学性质进行研究,得出如下结论:酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性。其水解对硝基苯酚酯的最适反应pH值范围是8.0～8.5,与游离的CALB商品酶相比,向碱性条件偏移。最适反应温度范围是40～45℃。最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,表现出极为明显的底物特异性。Ca2+、Mg2+对其有明显的激活作用。K+对其有微弱的激活作用。而Co2+、Cu2+对其有明显的抑制作用。本研究为酵母表面展示脂肪酶的应用研究奠定理论基础。

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B,CALB）的表达量,根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子（10 mmol/L）Ca2＋,Zn2＋,Mn2＋有助于CALB酶活力的提高,而Cu2＋,Ag＋,Fe3＋强烈抑制酶催化反应.

固定化假丝酵母脂肪酶合成棕榈酸异辛酯

开发了固定化假丝酵母脂肪酶 99 12 5合成棕榈酸异辛酯的工艺 .对反应温度、酶用量、底物摩尔比等酯化反应条件进行了研究 .脂肪酶以吸附的形式固定在织物膜上 ,以 1g棕榈酸、 0 6 7g异辛醇、 0 12g固定化脂肪酶和 5ml石油醚组成的反应系统在 4 0℃条件下反应 2 4h ,酯化率可达 96 6 % .固定化酶连续反应 9批后酯化率仍维持在 90

214型离子交换树脂固定化假丝酵母脂肪酶的研究

以假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase)催化脂肪酸甲酯化是植物油精制副产物中提取天然维生素E的重要预处理反应.为提高预处理效果,通过固定化假丝酵母脂肪酶提高其酯化能力,降低水解反应的能力.笔者在不同性能树脂筛选的基础上,开展了离子交换树脂214型固定化假丝酵母脂肪酶的研究.以酶固定化率为指标,开展了酶质量浓度、树脂的量、缓冲液pH、固定化温度、时间和振荡速率等条件试验和响应面试验,得到的最适固定化条件为酶质量浓度6.09mg/mL,5mL酶液中加入0.75g树脂,缓冲液pH 8.4,振荡转速134.26r/min,固定化温度30℃,固定化时间4h.该条件下,假丝酵母脂肪酶与树脂的结合率最高,酶的水解作用基本消失,酯化能力得到保持,可以获得较好的维生素E提纯预处理效果.

固定化假丝酵母脂肪酶催化合成辛酸甘油酯

以自制固定化假丝酵母脂肪酶作为催化剂,研究了无溶剂体系中辛酸和甘油直接酯化合成辛酸甘油酯的反应条件。考察了酶的种类、底物的物质的量之比、温度、酶量、甘油的初始含水量和反应时间等因素对辛酸转化率和产物组成的影响。结果证明,以纺织物作为载体制备的固定化假丝酵母脂肪酶适宜催化辛酸甘油酯的合成。最优反应条件为:辛酸与甘油的物质的量之比为2∶1,固定化假丝酵母脂肪酶加量为0.5g/0.69g甘油,温度为40℃,振荡培养箱转速为190 r/min。最优反应条件下辛酸转化率可以达到94%以上,经过简单处理的固定化酶可以重复使用4批。

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA（含pAOX1启动子）和pGAPZαA（含pGAP启动子）中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96 h后,CLAB活力达到11.1 U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2 U/mL,蛋白质量浓度为1.36 mg/mL.体积分数12％SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36 kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5 -9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5％.5 mmol/L Mg^2＋、Ni^＋、Co^2＋和体积分数0.10％ SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05％ Triton X-100对CALB稍有激活作用。

表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母FM22发酵培养基响应面优化

FM22培养基以丰富的氮源、较强的适应性等优势,适用于毕赤酵母发酵。为进一步对毕赤酵母发酵表达南极假丝酵母脂肪酶B进行优化,选取培养基中对其影响较大的CaSO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、PTM4为自变量,酶活力为响应值。通过单因素试验得自变量最佳值及高低水平,再采用Box-Behnken组合设计方法,模拟二次多项式回归方程的预测模型,研究各自变量及其交互作用对酶活力的影响。最终得到自变量最佳值:KH2PO445.02g/L、(NH4)2SO45.63g/L、CaSO40.46g/L、PTM4 1.63mL/L,酶活力为3214.7U/gDCW,较优化前提高约40%。

磁性多孔微球固定化假丝酵母脂肪酶的研究

通过悬浮聚合法制备了含环氧基团的聚合物载体高分子磁性多孔微球（GHD），用TEM、SEM和Micromeritics ASAP2010等对聚合物载体进行了表征。考察了载体中交联剂含量、固定化时间、给酶量等因素对固定化脂肪酶催化活性的影响。结果表明，Fe3O3纳米粒子粒径20nm，分布均匀，磁性多孔微球粒径从几十微米到一百多微米，粒子大小大体呈正态分布且分布较窄，平均粒径为110μm，直径在区间80—150μm范围内的粒子占90％以上。微球表面呈皱褶态且呈现多孔性，孔径从几个纳米到几十纳米，为闭孔，且孔间互相贯穿。固定化酶最适条件为给酶量125mg／g，固定化时间7h，此时酶的吸附量为118．5mg／g，比酶活7．56×10^5U／g，酶的活力回收率95％。以GHD为载体制备的固定化脂肪酶最佳反应温度从37℃上升到42℃，最适反应pH从7．2提高到7．5，固定化后酶对温度和pH的敏感性降低，重复使用12次，固定化酶的活力都能保持在92％以上。

南极假丝酵母脂肪酶B的固定化及其在合成维生素A棕榈酸酯中的应用

从10种树脂中筛选出3种固定化效果较好的树脂ECR1030M、LX-1000EP和MC150EP,优化南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法。其物理吸附法固定化的最佳参数为:介质为p H 8.0或6.0的Na_2HPO_4-柠檬酸缓冲液,18 g/L酶液和树脂按20∶1(V/W)比例混合,30℃、180 r/min固定化3 h,应用于维生素A棕榈酸酯合成研究,所得固定化脂肪酶的酯化比酶活分别为1 055.7 U/g(ECR1030M树脂)、1 077.0 U/g(LX-1000EP树脂)和1 024.3 U/g(MC150EP树脂),同时对固定化酶的性质进行了研究,其中,ECR1030M树脂固定化酶表现出更好的操作稳定性,重复使用7个批次反应后,固定化CALB的残余酶活90%以上,维生素A棕榈酸酯的产率达85%以上。

柱状假丝酵母脂肪酶同工酶的一种高效液相色谱分离新方法

建立一种“疏水界面亲和色谱”分离柱状假丝酵母脂肪酶同工酶的高效液相色谱新方法。将商品化的CRL经离子交换色谱分离为两个同工酶组分 (CRLA和CRLB) ,在极低离子强度下 ,根据同工酶活性中心周围处于“开放”构象的疏水腔具亲疏水界面的特性 ,用疏水界面亲和色谱在NucleosilC4 (10 μ ,3 0 0 ,2 5 0× 4.60mm)柱上将CRLA和CRLB都分离为 4种同工酶组分。

固定化假丝酵母脂肪酶对光皮树油的吸附性能

通过TEM、比表面孔分布测定仪等对含环氧基团的聚合物载体(GHD)性能进行了表征。以GHD为载体,制备了固定化假丝酵母脂肪酶。研究了光皮树油在固定化假丝酵母脂肪酶(I-CRL)上的吸附行为,从吸附平衡和吸附动力学角度探讨了吸附机理。结果表明,光皮树油在I-CRL上的等温吸附过程符合Langmiur方程,为单分子层吸附。实验数据能很好的拟合二级动力学吸附方程,当采用聚合物GHD(40)为载体,初始光皮树油浓度(Ce)为210 mg/g,在温度为325 K,330 K,335 K时,由Arrhenius公式求得的表观活化能Ea为30.44 kJ/mol,吸附过程为吸热反应。

南极假丝酵母脂肪酶B在制备手性药物中的应用

结合近期国内外的文献,本文详细介绍了南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)在手性醇、胺、酸选择性的拆分以及转酯等的应用。利用脂肪酶合成手性药物是药物合成研究的一个重要领域,CALB在一些药物的拆分和合成中表现出了良好的选择性,本文主要综述了其在手性醇、胺、酸选择性拆分以及转酯中的应用,希望能够为手性药物的合成提供方向。

固定化南极假丝酵母脂肪酶B催化合成乳酸乙酯的研究

选择固定化南极假丝酵母脂肪酶B(Candida Antaractic Lipase B)为催化剂(自制)催化合成乳酸乙酯.利用Plackett-Burman及响应曲面(RSM)法优化反应条件,考察摇床转速、反应温度、底物物质的量之比、底物总质量及反应时间对乳酸乙酯产率的影响.Plackett-Burman实验表明:摇床转速、底物总质量以及反应时间是主要影响因素.对该三因素进行五水平的中心组合设计实验,结果表明,在摇床转速为150 r/min,反应温度为50℃,乳酸与无水乙醇的物质的量之比为1∶8,底物总质量为1.24 g,反应时间为24 h时,乳酸乙酯的产率为38.15%.

表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的重组毕赤酵母高密度发酵条件优化

以Invitrogen公司提供的毕赤酵母发酵工艺手册为依据,先用摇瓶模拟甘油分批发酵,确定了表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticlipase B,CALB)的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需几种重要配方的最佳浓度为:甘油含量40g/L、硫酸铵4g/L、PTM14mL/L和CaSO410mmol/L;然后利用多功能补料摇床确定了菌株最适生长和产酶的pH分别为5.5和7.0,最适生长和产酶温度为30℃;再在2L发酵罐上放大,并对甘油流加模式和甲醇流加模式进行了优化筛选,确定了以9.6mL/(L.h)的流速流加甘油12h能有效提高菌体密度;以6.4mL/(L.h)的流速恒速流加甲醇比恒定溶氧流加甲醇诱导产酶更佳。最终单位菌体酶活力可达348.4U/g,比甘油含量40g/L、硫酸铵10g/L、PTM14.35mL/L、CaSO40.93g/L,以6.4mL/(L.h)的流速流加甘油4h和以恒定溶氧流加甲醇的未优化条件下提高34.8%。最后通过细胞表面荧光强度检测和全细胞催化合成活力对比,发现优化后单位菌体展示的蛋白表达量得到提高。

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)表达量,根据黑曲霉(Aspergillus niger)密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50℃和8.0,在pH 6.0~9.0和45℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2+、Zn2+和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2+、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。

南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造

南极假丝酵母脂肪酶B是用途最为广泛的脂肪酶之一,可用于许多有机化合物、医药中间体等的合成。为了改善南极假丝酵母脂肪酶B的催化性能,提高其环境适应性,同时提高蛋白的表达量,降低生产成本,从而使其更适于工业化应用,许多针对酶蛋白分子的修饰及改造方法已在南极假丝酵母脂肪酶B中得到大量应用。本文从化学修饰、理性设计和非理性设计3个方面详细综述了南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造的关键技术,包括定点突变、蛋白质融合、易错PCR和DNA改组等,同时也介绍了以上技术在改良南极假丝酵母脂肪酶B特性方面的诸多成功实例。

响应面法优化皱褶假丝酵母脂肪酶催化合成甾醇共轭亚油酸酯

以皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶为催化剂,在正己烷体系中催化植物甾醇与共轭亚油酸合成甾醇共轭亚油酸酯。以植物甾醇酯化率为考察指标,通过单因素实验和响应面实验确定最佳工艺参数为:酸醇摩尔比6∶1,反应温度40℃,酶用量9.6%(占底物质量),反应时间87 h。在此条件下,酯化率达97.5%。