海洋细菌假交替单胞菌DL-6来源β-N-乙酰己糖胺酶异源表达及酶学表征

从海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL-6中克隆β-N-乙酰己糖胺酶基因(PsHex),扩增至pET-28a(+),并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,经镍-次氮基三乙酸亲和层析纯化得到纯蛋白。结果表明:PsHex编码876个氨基酸,分子质量约99.46 kDa,理论等电点5.65,序列对比分析表明,Ps Hex属于糖苷水解酶GH20家族;Ps Hex蛋白最适温度30℃,最适pH 8.5,比活力11.30 U/mg,且在20℃、pH 7.5时稳定性最高;重组蛋白可降解琼脂、葡聚糖、可溶性淀粉、卡拉胶等多种底物;Na^(+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、K^(+)、Ca^(2+)、二硫苏糖醇、吐温-80、乙二胺四乙酸、β-巯基乙醇对酶有激活作用;Ps Hex以对硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷为底物的米氏常数(K_(m))为2.523 mol/L、转化效率(K_(cat))为79.035 min^(-1)、最大反应速率(v_(max))为2.081 U/mg、K_(cat)/K_(m)=31.326。该研究为酶法降解几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺的生产应用提供了理论参考。

纤维素对海假交替单胞菌生物被膜生物学特性及厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为探究纤维素对海假交替单胞菌生物被膜的生物学特性及其对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响,实验设置海假交替单胞菌(初始细菌密度5×10^(8)个/m L)分别与浓度为0.02、0.20、2.00、20.00 mg/L的纤维素共孵育形成生物被膜,检测形成的生物被膜对厚壳贻贝幼虫变态的诱导作用变化,比较生物被膜成膜能力、胞外产物等生物学特性变化,并分析其与厚壳贻贝幼虫附着变态的关系。纤维素浓度为2.00或20.00 mg/L时,所形成的生物被膜对幼虫附着变态的诱导活性显著降低。通过分析加入纤维素后海假交替单胞菌形成的生物被膜生物学特性发现,随着纤维素浓度升高,生物被膜中细菌的分布更为分散,细菌密度和膜厚呈逐渐降低趋势,生物被膜胞外产物中α-多糖、β-多糖和脂质的生物量显著降低,而蛋白无明显变化。在海假交替单胞菌生物被膜形成过程中,纤维素主要通过降低胞外α-多糖、β-多糖和脂质的产生,进而间接调控厚壳贻贝幼虫附着变态。研究结果为探究海假交替单胞菌纤维素对生物被膜形成及对厚壳贻贝附着变态调控分子机制提供理论依据,为整治生物污损等实际问题提供新思路。

海洋假交替单胞菌端生和侧生鞭毛对生物膜形成的影响

海洋假交替单胞菌广泛分布于各种海洋环境中,能分泌多种生物活性物质和胞外酶类,多具有较强的生物膜形成能力。这些生物膜具有诱导矿化和吸引腐蚀生物幼体附着的功能,在海洋生态系统的能量和元素循环中扮演特殊角色。细菌的鞭毛系统介导细菌的运动行为,在营养的获取以及生物膜和浮游状态转化过程中发挥作用。有研究表明,鞭毛也是生物膜基质的有机组分,但目前海洋假交替单胞菌鞭毛系统在生物膜形成中的作用尚不清楚。本文以南海表层来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.SCSIO 11900)和深海沉积物来源的近源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas.sp.SM9913)为研究对象,分别选取了编码鞭毛不同组分的基因进行敲除,研究鞭毛缺失对细胞游动性和生物膜形成能力的影响。结果表明,无论来自表层还是深海的假交替单胞菌都使用端生鞭毛维持细胞游动性,而且其缺失促进生物膜的形成。此外,深海来源的SM9913还具有侧生鞭毛。尽管这种鞭毛有助于提高细胞游动性,却不影响细菌的生物膜形成能力。这些端生鞭毛系统在近缘海洋假交替单胞菌中广泛分布,可能为该属菌株在不同海洋环境中获取营养、定殖及适应环境的过程中发挥重要作用。

一株假交替单胞菌DL3的抑菌与群体感应淬灭活性研究

本实验室从水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离到一株菌DL3,为了明确该菌株的活性及作为有益菌进行应用的可能,通过细菌分离培养、16S rRNA测序和系统发育分析对其做了初步鉴定,并采用牛津杯法、平板法分别测定了菌株的抑菌活性和群体感应淬灭活性。基于菌株DL3 16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株与解肽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas peptidolytica)NBRC 101021T的相似性最高,亲缘关系最近,为99.64%;抑菌试验显示,该菌株对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichi coli)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏杆菌(Shigella)、河弧菌(V.fluvialis)、东方弧菌(V.orientalis)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的生长表现出不同程度的抑制作用,且在培养72 h时抑菌活性最强;平板法检测结果表明,菌株DL3具有群体感应淬灭活性,对3-oxo-C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C14-HSL等信号分子具有较强的淬灭效果。本研究成功分离到假交替单胞菌DL3,并明确了其拮抗病原菌的活性,为后续深入开展菌株DL3及其活性产物的抑菌机制研究、探索海洋微生物在动物细菌性病害防治中的应用奠定了基础。

海洋假交替单胞菌SM9913中基因岛GIPspSM9913的鉴定和功能研究

海洋细菌由于所处环境的复杂性和多变性,进化出独特的环境适应机制。基因岛通常携带宿主细菌环境适应性有关的基因,在推动细菌环境适应性和基因组多样化中起重要作用。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)在各种海洋生境中广泛分布,具有重要的工业应用价值和生态修复潜力。文章以深海沉积物中分离的假交替单胞菌SM9913为研究对象,通过与表层海水中分离的假交替单胞菌TAC125进行比较基因组学分析,发现SM9913基因组上yicC基因内部整合了一个18kb的基因岛,我们命名为GIPsp SM9913。该基因岛编码整合酶、切离酶以及多套限制修饰系统。数据库检索分析发现GIPsp SM9913同源的基因岛在假交替单胞菌、希瓦氏菌(Shewanella)、弧菌(Vibrio)和气单胞菌(Aeromonas)等细菌中广泛存在。定量PCR结果显示,当切离酶表达时,GIPsp SM9913会从基因组上大量切离,产生无基因岛的SM9913突变株。测序分析表明,GIPsp SM9913的切除不会影响整合位点侧翼基因的表达。比较切离突变株与野生菌的运动能力、电转化频率和接合转移效率等,发现GIPsp SM9913可以提高宿主细菌的泳动能力和对外源DNA入侵的抵御能力。

一株虾源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)的分离鉴定及口服后对对虾体内弧菌的影响

为探讨对虾细菌性病原的微生物防控技术,采用牛津杯打孔法对分离自对虾育苗池的一株编号为2021041402-14的细菌(简称“02HN”)进行了抗菌测试,分析其对欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等6株虾病原菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,通过浸泡感染测试了菌株02HN对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生物毒性,采用16S rRNA、gyrB-rpoD串联基因序列比对法及生理生化方法对该菌进行了鉴定,并将该菌添加到饲料中投喂对虾,评价该菌对对虾体内弧菌数量的影响。结果表明:菌株02HN对欧文氏弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌均具有抑菌效果,其最低抑菌浓度分别为2.32×10~4、2.32×10~3、2.32×10~6、2.32×10~6、2.32×10~3、2.32×10~6 CFU/mL;采用02HN浓度为1×10~7 CFU/mL以下的菌液浸泡凡纳滨对虾,生物毒性不明显;分子鉴定显示,该菌与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)及金丽假交替单胞菌(P.flavipulchra)最为接近,为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.);对虾摄食菌含量分别为1×10~5、1×10~7cells/g的饵料后,其存活及生长无显著性变化,但能显著降低对虾肝胰腺中的弧菌数量(P<0.05)。研究表明,菌株02HN在对虾养殖中具有开发应用潜能,本研究结果可为对虾细菌性病原的生物防控提供生物材料及技术思路。

响应面法优化杀鱼假交替单胞菌2515发酵培养基

杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2515是一株具有广谱抗弧菌性能的菌株,为提升菌株2515的培养生物量,通过单因素优化方法,研究碳源、氮源、无机盐等营养成分对菌株2515的发酵产量的影响,确定关键营养因子,利用响应面分析法对影响菌株2515生物量的关键营养因子进行优化。结果显示,菌株2515的最佳发酵培养基配方为麦芽糖2.85 g/L、CaCl20.65 g/L、MnCl20.10 g/L、酵母膏3.85 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。优化后的培养基使菌株2515在锥形瓶和发酵罐中发酵的OD_(600)值分别为1.416和1.866,生物量分别提高了36.4%和40.4%,其发酵上清液和细胞内容物的抑菌活性分别提高了28.2%和27.2%。表明响应面法优化后的培养基有利于提高菌株2515的发酵生物量及抗菌效果,研究结果为菌株2515的后续开发应用提供了参考。

1株引起条斑紫菜绿斑病的柠檬假交替单胞菌

从栽培海区采回的发病条斑紫菜 (Porphyraeyezoensis)上共分离筛选出 5 1株菌株 ,全部进行人工感染 ,其中 17# 菌株发病症状最典型 ,而感染对照组没有可见变化。初步确定 ,17# 菌株是条斑紫菜绿斑病的主要致病菌。17# 菌株为短杆状、极生单鞭毛可运动的革兰氏阴性菌 ,产生紫褐色色素 ,可水解明胶、酪蛋白、淀粉等大分子物质。葡萄糖氧化发酵试验 (O/F)为氧化性、氧化酶阳性、ONPG反应阳性 ,V -P反应阴性 ,生长需Na+ 等生化特性 ,G +C含量 4 0 .5mol% ,脂肪酸主要成分为C17∶1ω8c和C16∶1ω7c。基于 16SrRNA的系统进化分析均表明 ,从患绿斑病的条斑紫菜叶状体上分离到的致病菌株 17# 与柠檬假交替单胞菌 (Pseudoalteromonascitrea)

假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.AJ5产κ-卡拉胶酶的培养条件优化(英文)

【目的】本研究的目的是优化Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株的培养条件使之产生高活性的胞外κ-卡拉胶酶。【方法】通过富集培养技术从刺参肠道分离出一株卡拉胶降解菌AJ5,该菌株能利用卡拉胶作为惟一碳源和能源。依据形态学和生理学特征及16SrRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化。【结果】单因素试验结果表明,Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株的最佳培养条件为250mL三角瓶装入75mL发酵培养基、摇床转速150r/min、接种量7%、pH8.0。单因素试验和正交试验结果显示该菌株的最佳培养基组成为κ-卡拉胶1g/L、牛肉膏2g/L、NaCl20g/L、K2HPO4·3H2O1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、MnCl2·4H2O0.2g/L、FePO4·4H2O0.01g/L;培养温度为28℃,培养时间为28h。【结论】Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株分泌胞外κ-卡拉胶酶,在最佳培养条件下,该菌株的κ-卡拉胶酶活力比优化前提高了4倍。

致病性假交替单胞菌的分离鉴定及药敏特性研究

[目的]分离鉴定患病的七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus Thunberg)的致病菌,并研究其药敏特性。[方法]从患病的七带石斑鱼体内分离出1株致病菌BY0081。通过ATB微生物鉴定系统和菌体常规形态特征、生理生化反应指标测定以及16S rDNA测序分析等进行综合鉴定;通过人工感染水生模式动物剑尾鱼测定该菌株对其的半数致死量(LD50);最后进行药敏试验确定其药敏特性。[结果]致病菌BY0081为革兰氏阴性菌,菌落呈米色,边缘光滑,中间略有隆起,为假交替单胞菌(Pseudoa lteromonas sp.)。其在较低的温度下仍有较强的毒力,其对水生模式动物剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的LD50为2.82×105cfu/g鱼体重。该菌对菌必治、复方新诺明、氯霉素和氟哌酸等抗生素高度敏感,对复达欣、红霉素、丁胺卡那霉素和庆大霉素等药物中度敏感。[结论]该研究对防治由假交替单胞菌引起的鱼类疾病有积极意义。

假交替单胞菌JIV-49产抗真菌活性物质的发酵条件研究

目的:对假交替单胞菌JIV-49进行了发酵条件的研究。方法:采用单因素实验法对JIV-49产抗真菌活性物质的发酵培养基及主要的影响因子如初始pH值、温度、培养时间、接种量、转速、摇瓶装液量等进行了考察。结果:确定了最佳培养基为:牛肉膏为2.5%、KBr为0.01%、盐浓度为6%;最佳培养条件为:初始pH值为7.5、温度为30℃、培养时间为96h、接种量为7%,摇床转速为180r/min,摇瓶装液量为75ml/500ml。结论:初步确定了JIV-49发酵的条件,为工业化生产抗真菌活性物质提供了科学依据。

假交替单胞菌及其胞外生物活性物质研究进展

假交替单胞菌是新建立的一个海洋细菌属,它独特的生物学特性引起了越来越多研究者的关注。简介了假交替单胞菌的分类地位、生态分布等特点,重点阐述了假交替单胞菌生物活性物质的种类及其生物活性,最后对假交替单胞菌的应用前景进行了展望。

1株黑鲷致病性假交替单胞菌的鉴定及毒力基因分析

从患有尾鳍基部溃烂病的人工养殖黑鲷(Acanthopagrus schlegel)病灶处分离到1株优势菌LSHD-1,经人工感染试验证实为引起黑鲷尾鳍基部溃烂病病原菌。细菌形态学观察、生理生化等表观、生物学试验、细菌16S rRNA基因同源性检索和系统发育学分析结果表明,LSHD-1与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的吻合程度最高,系统发育分析结果与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)聚为1支。扩增细菌毒力基因,分析其潜在致病性,发现LSHD-1携带黏附侵袭位点基因(ail)、毒力活化因子(vir F)、P4噬菌体整合酶基因(int B)、溶血素基因(hly A)、丝氨酸蛋白酶基因(ahp A)、肠毒素基因(alt A)、抗金属蛋白酶基因(ast)。药敏试验结果显示,LSHD-1对氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、头孢曲松、氟苯尼考高度敏感,对磺胺异唑、强力霉素、青霉素G、四环素表现出较强耐药性。

北极耐冷假交替单胞菌的培养温度对其胞外蛋白酶合成的影响

从北极楚科奇海水中分离筛选到2株产蛋白酶耐冷细菌BSw20308及BSw20353,经分子鉴定为假交替单胞菌属。这2株菌虽存在较近亲缘关系,16SrDNA序列相似性为98%,但属于不同种,表型方面也存在差异。酶谱分析显示,此2株菌的胞外产物中存在至少3种蛋白水解活性组分。培养温度的变化对这2株菌胞外蛋白水解活性组分的生成具有不同的影响效果,表明极地海洋细菌可能在酶学水平上通过酶的种类与活力的调整和采取不同的策略来适应环境温度的变化。

稻瘟病菌拮抗假交替单胞菌的分离与鉴定

为从海洋中分离并鉴定水稻稻瘟病菌拮抗菌,采用系列稀释法和对峙法筛选对稻瘟病菌具有较好抑菌活性的拮抗菌,根据其形态、生理特性及16S rDNA序列比对鉴定拮抗菌分类地位。结果:从辽宁省大连采集的样品中共分离到77株菌,以稻瘟病菌为指示菌,共筛选到9株具有拮抗作用的菌株,再通过发酵复筛,结果表明LM-003菌株的拮抗作用最好,且初步鉴定菌株LM-003为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)。试验表明,假交替单胞菌LM-003是1株有应用前景的生防菌株。

环境pH值和假交替单胞菌对颗石藻的影响

研究以浙江省象山港虾塘藻华中分离的一种颗石藻(Pleurochrysis carterae)为对象,比较了不同起始pH值(6.5、7.5和8.5)条件下颗石藻及其与紫菜藻际分离的假交替单胞菌Psuedoalteromonas sp.NPyS3共培养时颗石藻种群增殖特征及钙化情况。结果显示:1)环境pH值对颗石藻的生长具有极显著的影响(P<0.01),起始pH值为8.5的培养体系中颗石藻细胞密度最高,生长状况最好;pH值越低细胞密度越小;而且低pH值(6.5和7.5)会显著抑制颗石藻钙化(P<0.05);2)在3种起始pH值条件下,假交替单胞菌NPyS3均显著抑制颗石藻的生长与钙化,Two-way Anova分析表明菌对颗石藻的抑制作用远大于pH值对藻造成的影响。研究表明,环境pH值对颗石藻的生长与钙化都产生显著影响,碱性条件比较有利于其增殖和钙化;然而环境中拮抗生物因素对颗石藻生长及钙化的抑制远大于pH值降低等非生物因素的影响。

不同养殖区红藻表面假交替单胞菌多样性分析

利用2216E培养基从我国沿海6种养殖红藻的20个样品表面分离了327株假交替单胞菌。经过16S rDNA序列鉴定,分别隶属于Pseudoalteromonas carrageenovora、P.haloplanktis、P.marina、P.agarivorans、P.elyakovii和P.lipolytica 6个种。其中P.carrageenovora数量最多,总共211株,在14个样品上均有发现。

海洋假交替单胞菌抗真菌活性物质的纯化和鉴定

海洋假交替单胞菌JIV-49产生的抗真菌活性物质对白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌和须癣毛癣菌等多种真菌的生长有明显抑制作用。为了明确其抗真菌活性物质的化学本质,采用透析、活性炭脱色、丙酮-乙醇沉淀等方法对JIV-49发酵液中的抗真菌活性物质进行粗提取,得到了活性成分的粗提液。粗提液经AB-8大孔吸附树脂柱层析、Sephadex G-100柱层析和Sephadex G-25柱层析进一步纯化,经硅胶薄层层析检查证明抗真菌活性物质已得到纯化,得到海洋细菌JIV-49产抗真菌活性成分的纯化物。对纯化后的抗真菌活性物质进行茚三酮反应、紫外光谱和红外光谱分析,确定该活性物质为环脂肽。对该活性物质进行抗真菌谱分析,发现该物质的抗真菌谱比目前临床使用的抗真菌药物更广。

海洋假交替单胞菌CI4菌株抗菌蛋白分离纯化的初步研究

将海洋假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.CI4菌株于VNSS液体培养基中培养,获得浓缩无细胞上清液,采用纸片扩散法检测其抗菌活性。结果表明,该菌株的胞外产物能够抑制从岩石表面分离的污损细菌S1菌株和其自身的生长。除去菌体培养液,用饱和度为70%的硫酸铵沉淀,所得的拮抗物粗提液对热部分敏感,对蛋白酶K和链霉蛋白酶敏感,其作用的活性pH稳定范围为5.0-9.0。粗提液经Sephadex G-200柱层析、DE-52纤维素离子交换柱层析,Microcon离心超滤管分级和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）跟踪检测,得到电泳纯抗菌蛋白,其相对分子质量为37 200。

假交替单胞菌对哈维氏弧菌拮抗作用初探

以2216E作为培养基,通过补加氮源和碳源,可使假交替单胞菌WCPW15003的菌悬液中菌体密度由2.31×10^8 cfu/mL升至3.36×10^9 cfu/mL。在pH 7.6、温度30℃、盐度30条件下,当哈维氏弧菌PBVH3311分别为10^3、10^4、10^5、10^6、10^7、10^8 cfu/mL时,假交替单胞菌WCPW15003最小抑菌密度分别为10^3、10^5、10^5、10^7、10^8、10^8 cfu/mL,对应抑菌圈直径分别为(8.40±0.16)、(9.64±0.07)、(8.24±0.22)、(18.15±0.09)、(18.53±1.34)、(11.68±2.58)mm。当哈维氏弧菌PBVH3311密度为10^3~10^5 cfu/mL时,实现10^0%拮抗作用的方程为:6.06=9.09-0.3339 x+0.02325 y+0.00267 x^2-0.0002273 xy+0.0002477 y^2;当哈维氏弧菌PBVH3311密度为10^6~10^8 cfu/mL时,实现10^0%拮抗作用的方程为:6.25=8.395-0.1682 x+0.1161 y+0.0010^6 x^2-0.00000675 xy-0.00010^26 y^2。本研究结果将为今后开发防治热带海水养殖哈维氏弧菌病原的益生菌制剂及其施用技术奠定良好基础。