降解2,4-二氯酚的假单胞菌GT241-1的特性及其3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因定位

从 2 ,4 -二氯酚生产厂排污口污泥中分离并筛选到一株降解 2 ,4 -二氯酚的细菌 GT2 4 1- 1,经鉴定属假单胞菌属 .菌株 GT2 4 1- 1能在 4 8h内将 90 mg/ L的 2 ,4 -二氯酚降解 91% . GC/ MS分析表明 ,该菌株能将 2 ,4 -二氯酚彻底降解而不积累中间代谢产物 .经 38℃热处理 ,菌株 GT2 4 1- 1中有 1.9%丧失了 2 ,4 -二氯酚降解能力 .菌株 GT2 4 1- 1有两条大质粒带 .Southern杂交表明 ,菌株 GT2 4 1- 1的 3,5-二氯儿茶酚 1,2 -双加氧酶基因定位于约 11kb的 Eco RI/ Xba

降解1,2,4-三氯苯的硝基还原假单胞菌J5-1的分离鉴定和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆

从受氯苯污染的土壤中分离到1株以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长的细菌,命名为J5-1.根据其生理生化特征和16SrDNA(GenBank Accession No.EF107515)序列相似性分析,将该菌株初步鉴定为硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens).当1,2,4-三氯苯初始浓度为400 mg/L时,J5-1对其最大降解率接近90%;当1,2,4-三氯苯浓度初始为20 mg/L时,降解效果最好.J5-1对1,2,4-TCB的降解服从一级反应动力学.从J5-1的基因组DNA中克隆到CC12O的全长序列.

假单胞菌23-1菌株烃代谢产生有机酸和气体的研究

假单胞菌 2 3- 1烃代谢产生乙酸 ,产酸量 0 .0 15mol/L ;产生 CO2 和 CH4 两种气体 ,产气量 2 0 m L /L。产酸产气 2 3- 1菌株成为微生物采油优良菌种。

假单胞菌M18rsmA^-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌 (Pseudomonassp .)M18是促进植物生长的根际细菌 ,能产生吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌 ,保护植物免受病害。运用PCR方法 ,从M18基因组中 ,扩增出rsmA基因部分片段 ,并以该片段为探针 ,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆 ,切取带有rsmA基因及两侧序列的 1 5kb片段 ,中间插入编码Kmr 的DNA片段 ,获得rsmA- 体外突变体。运用同源重组剔除技术 ,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R- 。突变株M18R- 生物合成Plt的能力比野生型M18提高 4倍 ,但是 ,PCA产量仅为野生型的 2 0 %。研究结果表明 ,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。

铜绿假单胞菌对支气管扩张患者气道中基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的影响

目的对不同细菌感染的支气管扩张(BE)患者气道中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的表达进行研究,分析铜绿假单胞菌(PAE)对MMP-9、TIMP-1表达的影响。方法采用病例对照研究的方法,分设BE组及对照组,BE组又根据支气管肺泡灌洗液(BALF)培养结果分为PAE组及其他菌株组两个亚组。收集患者的BALF,ELISA法检测其中MMP-9和TIMP-1的浓度,并计算TIMP-1/MMP-9比值。同时取气管内膜活检组织,免疫组织化学法检测其中MMP-9及TIMP-1的表达。结果 MMP-9在PAE组及其他菌株组的BALF中均明显升高(P均=0.0000);MMP-9在PAE组(P=0.0421)及其他菌株组(P=0.0003)支气管内膜活检组织中的表达亦明显升高。TIMP-1在PAE组BALF中的浓度明显低于其他菌株组(P=0.0324);BALF中TIMP-1/MMP-9比值在BE组明显低于对照组(P=0.0000),PAE组明显低于其他菌株组(P=0.0026)及对照组(P=0.0000),而其他菌株组又明显低于对照组(P=0.0000)。结论 PAE感染可能是通过促使MMP-9分泌并抑制TIMP-1同步分泌而使BE病情恶化。

sTREM-1在铜绿假单胞菌感染和定植的表达及意义

目的通过研究可溶性髓样细胞触发受体-1(sTREM-1)在铜绿假单胞菌呼吸系统感染和定植不同状态下表达水平的变化,探讨sTREM-1在铜绿假单胞菌肺炎及呼吸道定植中的意义。方法将90只SD大鼠随机分为肺部感染组、口咽部定植组及对照组,每组按铜绿假单胞菌接种后不同时间又分为3、9、24h亚组,每亚组10只。运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sTREM-1浓度;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织TREM-1mRNA表达;病理组织切片观察各组肺部炎症改变,并进行肺组织匀浆菌落计数。结果感染组大鼠肺组织病理改变在9h最为严重,而定植组和对照组的肺泡及肺间质结构基本正常;肺部感染组3、9、24h肺组织TREM-1mRNA的表达和血清中sTREM-1的浓度较定植组及对照组均明显增高(P<0.05),定植组与对照组TREM-1mRNA的表达和sTREM-1浓度的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论检测sTREM-1有助于鉴别铜绿假单胞菌感染与定植;动态监测sTREM-1的变化对感染性疾病的早期诊断和病情评估具有指导意义。

假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控

假单胞菌株M18分泌藤黄绿脓菌素 (Pyoluteorin ,Plt )和吩嗪 1 羧酸 (Phenazine 1 carboxylicacid ,PCA)并抑制多种植物病菌的生长。从M18中克隆双基因调控系统gacS gacA的组成基因gacA ,并构建了该基因抗性插入突变株M18G。在KMB培养基中 ,M18G合成Plt的能力受到完全抑制 ,而PCA的积累约比野生型提高 31倍左右。Plt合成基因簇突变株M18T和在M18G基础上构建的PCA合成基因簇突变株M18GA的Plt和PCA合成的动力学变化表明 ,在M18G菌株中 ,Plt合成的抑制并不引起PCA的过量积累 ,PCA的过量积累也不引起Plt合成的抑制。由此推测 。

假单胞菌(Pseudomonas sp. cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达

参照几种生物的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因 (mtlD)的序列设计引物 ,以极端耐盐的假单胞菌 (Pseudomonassp cn 4 90 2 )的总DNA为模板 ,采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法 ,进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明 ,克隆获得一长为 114 9bp的基因。经蛋白质保守区域研究 ,初步判别该基因为mtlD结构基因。将该基因与pBV2 2 0质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS PAGE电泳表明 ,含pBH的转化子产生特异的、分子量约为 4 1kD的蛋白带 ,表达量约占菌体可溶性蛋白 6 7%。转化子的耐盐水平比对照提高了约 1/5。在含 0 9mol/LNaCl的液体培养基中 ,转化子培养 2 4h后其生物量约是对照的 10 2倍 ,甘露醇含量约是对照的 4 1倍。可见 ,假单胞菌的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因 ,该基因已在GenBank登记 ,代号为AY112 6 96。

施氏假单胞菌N2降解1-羟基-2萘甲酸的特性及机理研究

1-羟基-2-萘甲酸被认定为微生物修复多环芳烃(PAHs)污染过程中最易积累的一种含氧多环芳烃(OPAHs)中间产物,其对大多微生物有较强毒性,并且该物质的积累会抑制微生物对PAHs污染环境的成功修复.本文以施氏假单胞菌N2为对象,研究该菌株对1-羟基-2-萘甲酸的降解代谢能力和特性,并利用GC-MS对降解过程中积累的OPAHs进行鉴定和分析.研究结果表明,N2菌能够以50 mg/L卜羟基-2-萘甲酸为唯一碳源和能源生长,并在以辛烷为共代谢碳源时其生长量和卜羟基-2-萘甲酸的降解率均可提高20%.通过对9种主要中间代谢产物的GC·MS分析,推测脱羧是N2菌降解1-羟基-2-萘甲酸的主要途径.该研究结果将为解决PAHs污染环境修复过程中OPAHs类高毒中间产物积累问题奠定基础.

1-氨基环丙烷-1-羧酸在恶臭假单胞菌趋化双孢蘑菇菌丝中的作用

真菌-细菌生物膜(FBB)在制备高效生物肥料接种剂和生防制剂中发挥着重要作用,探讨FBB的形成机理非常有必要。以双孢蘑菇和恶臭假单胞菌UW4为对象,研究了1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在双孢蘑菇-细菌生物膜形成过程中的作用。采用PDA平板培养双孢蘑菇菌丝,在距离菌丝尖端边缘处涂布UW4菌悬液,双孢蘑菇菌丝生长速度比涂布超纯水的对照组提高10.85%,同时,显微镜和扫描电镜均可观察到UW4能够在双孢蘑菇菌丝表面形成菌膜。使用ACC合成酶抑制剂氨基氧乙酸(AOA)抑制双孢蘑菇菌丝ACC的合成,则UW4不能在双孢蘑菇菌丝表面形成菌膜。此外,UW4 ACC脱氨酶基因缺失突变株也不能形成菌膜。趋化试验发现,UW4可趋化ACC,趋化强度与双孢蘑菇菌丝分泌物中的强趋化物谷氨酰胺和柠檬酸类似,且ACC最适趋化浓度的趋化强度高于谷氨酰胺和柠檬酸最适趋化浓度的趋化强度。而UW4 ACC脱氨酶基因缺失突变株不能趋化ACC。转录组测序分析ACC对UW4基因表达的影响,发现ACC能够引起UW4中趋化和运动相关基因的表达水平发生显著的上调或下调。以上结果表明,ACC是假单胞菌趋化双孢蘑菇的一种强趋化物质,同时是产ACC脱氨酶细菌在真菌菌丝表面形成菌膜的关键信号物质。

基于SIRT1ROR-γt通路探讨白藜芦醇对铜绿假单胞菌诱导的免疫抑制肺炎小鼠的治疗作用

目的基于沉默信息调节蛋白1(SIRT1)/核孤儿受体-γt(ROR-γt)通路探讨白藜芦醇对铜绿假单胞菌肺炎免疫抑制小鼠的治疗作用。方法将小鼠随机分成空白组、铜绿假单胞菌肺炎(PA)组、免疫抑制组、免疫抑制+PA组及免疫抑制+PA+白藜芦醇组,每组18只。各组小鼠于造模成功后的4、8、24h处死,苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理变化,进行肺组织病理学评分,酶联免疫吸附(ELISA)法检测外周血中IL-17表达水平,实时荧光定量PCR技术检测肺组织SIRT1、ROR-γt mRNA表达,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测肺组织SIRT1、ROR-γt蛋白水平。结果与空白组相比,PA组、免疫抑制组和免疫抑制+PA组肺泡结构严重破坏,肺泡内可见大量中性粒细胞和炎性细胞浸润,小鼠肺组织病理学评分、IL-17的含量、ROR-γt mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05),SIRT1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与免疫抑制+PA组相比,免疫抑制+PA+白藜芦醇组小鼠肺组织的病理症状减轻,炎性细胞浸润减少,小鼠肺组织病理学评分、IL-17的含量、ROR-γt mRNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05),SIRT1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。结论白藜芦醇可能通过上调SIRT1表达,下调ROR-γt表达,抑制炎症反应,从而减轻铜绿假单胞菌诱导的免疫抑制肺炎小鼠的肺组织损伤。

髓样细胞触发受体-1与铜绿假单胞菌感染和定植的相关性

目的:通过研究髓样细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)在铜绿假单胞菌呼吸系统感染和定植不同状态下表达水平的变化,探讨TREM-1与铜绿假单胞菌肺炎及呼吸道定植的相关性。方法:将90只SD大鼠随机分为肺部感染组、口咽部定植组及生理盐水对照组,并分别在3、9、24h运用ELISA法检测血清sTREM-1、C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)浓度;病理组织切片观察各组肺部炎症改变。结果:感染组3、9、24h血清sTREM-1、CRP及PCT的水平较定植组和对照组均明显增高(均P<0.05),定植组与对照组各指标比较差异没有统计学意义;感染组血清sTREM-1浓度与CRP、PCT含量呈正相关(相关系数分别为0.86和0.75,均P<0.01);肺组织病理改变在感染组9h最为严重。结论:TREM-1的检测有助于铜绿假单胞菌感染与定植的鉴别;TREM-1对感染性疾病预后判断有指导意义;在感染性疾病的诊断中血清sTREM-1与炎症指标CRP,PCT具有同样重要的意义。

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍 (NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M 18存活率的影响 ,NTG的诱变剂量 2 5～ 2 0 0mg/L ,处理时间 10～ 30min范围内 ,随着诱变剂剂量增加和时间的延长 ,M 18的存活率不断下降。NTG的作用剂量 2 5mg/L ,处理时间 10min时 ,细菌存活率为 5 5 %左右。利用细菌存活率为 5 5 %时的诱变条件 ,经生物测定 ,初筛获得 2 0株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛 ,从这 2 0株诱变株中 ,获得PCA高产诱变株M 18N0 7。并对此菌株发酵条件进行调整 ,较理想的培养条件为 :蛋白胨 18g/L ,葡萄糖 16 g/L ,氯化钠 1g/L ,硝酸钾10 g/L。小瓶培养时间 17h ,大瓶 5 %接种量 ,2 8℃培养 5 4h。

大鼠铜绿假单胞菌肺炎中IL-8及低氧诱导因子-1α的作用研究

目的观察大鼠铜绿假单胞菌肺炎模型中IL-8及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及两者之间的相关性。方法建立大鼠铜绿假单胞菌肺炎模型,ELISA法检测造模成功后3、9、24h大鼠血清中IL-8的浓度,并取3、9、24h大鼠肺组织切片行HE染色观察病理改变及免疫组化法检测HIF-1α蛋白在不同时间点的表达水平,并将IL-8及HIF-1α做相关性分析。结果在铜绿假单胞菌感染后3h大鼠血清中IL-8开始升高,9h更高,24h最高;HIF-1α的表达水平与IL-8的升高水平平行,且两者有明显相关性(r=0.974)。结论在铜绿假单胞菌肺炎的炎症过程中,IL-8与HIF-1α等炎症因子相互作用,促进炎症的发生发展。

假单胞菌M-18qscR突变株的构建及其对抗生素合成的调控

在革兰氏阴性菌中,全局性调控因子QscR参与菌群传感调节系统,调节多种毒素因子、次生代谢产物、稳定期基因以及参与生物膜形成的基因的表达,它通过与靶基因DNA启动子的调节元件结合,调节基因转录。假单胞菌株(Pseudomonas sp.)M-18是促进植物生长的根际细菌,能同时分泌藤黄绿菌素(pyoluterion,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)。运用同源重组技术,构建了假单胞菌(Pseudomonas sp.)M-18株的qscR突变菌株M-18Q。比较野生株M-18和突变株M-18Q生物合成PCA和Plt的产量,在28℃恒温条件下,在PPM和KMB培养基中M-18Q菌株合成PCA的量分别约为野生型M-18菌株的4～6倍和3～5倍,分别达到480μg/mL和140μg/mL。在PPM培养基中,野生株M-18和突变株M-18Q几乎都没有Plt的合成,而在KMB培养基中,突变菌株和野生型M-18合成Plt的量基本一致。反式互补实验表明,在qscR突变株M-18Q中,PCA生物合成受到抑制而Plt的生物合成却不受影响。phzA基因是吩嗪合成基因簇中第一个基因,phzA‘-’lacZ翻译融合实验表明,qscR基因产物通过抑制PCA合成基因簇的表达,实施负调控作用。结果表明qscR基因是作为一个全局调控基因区别性地调控PCA和Plt的生物合成。

温度对假单胞菌rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白 (Repressorofsecondarymetabolite ,Rsm)A是一种全局性调控因子 ,与mRNA的RBS结合 ,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术 ,构建了假单胞菌 (Pseudomonassp .)M_18的rsmA突变菌株M_18R。在 37℃、2 8℃恒温和短期升温 (37℃、4h培养 ,转 2 8℃继续培养 )条件下 ,比较野生株M_18和突变株M_18R生物合成藤黄绿菌素 (Plt)和吩嗪_1_羧酸 (PCA)的量。在 37℃条件下 ,M_18和M_18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在 2 8℃条件下 ,M_18R合成Plt的量约为野生型M_18的 10倍 ,达到 2 70 μg mL ,但是合成PCA的量仅为野生型的 5 0 %。经短期升温培养 ,M_18的Plt合成量明显下降 ,PCA产量降低不显著 ;相反 ,M_18R合成Plt的量达到 4 0 0 μg mL ,但PCA产量的变化仍不明显。推测 ,M_18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子 ,在RsmA缺失条件下 ,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成 ,但是 ,并不参与对PCA合成的调控。

绿针假单胞菌HT66中luxR_19对吩嗪-1-甲酰胺合成的影响

旨在研究调控基因lux R_19对绿针假单胞菌HT66中的抑菌物质吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)合成及菌体生长的影响,通过分子操作构建了lux R_19基因敲除株、回补菌株、过表达菌株以及lux R_19(G85A)点突变菌株,检测了目标菌株生长曲线、PCN发酵结果、细菌泳动性与从动性等。结果显示,将lux R_19敲除后PCN产量明显降低,对lux R_19基因进行过表达,发现能够将PCN产量提高2倍;lux R_19对于吩嗪合成的多个调控基因以及合成基因表达均产生影响;lux R_19的敲除对HT66的生长及泳动性不产生影响,而对细菌的从动性有一定的促进作用;lux R_19(G85A)点突变菌株吩嗪产量较野生型相差很小。结果表明,lux R_19对PCN的合成为正调控基因,一定程度上影响HT66的从动性,第254位碱基突变对PCN合成产量不产生影响。

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5-1A菌株的胞外木素过氧化物酶的部分纯化和鉴定(英文)

荧光假单胞菌GcM5-1A是松材线虫携带的一种致病菌。在GcM5-1A的培养液中发现有木质素过氧化物酶的活性,同时显示很强的毒性。通过对其胞外木质素过氧化物酶的酶学性质的初步研究发现:其最适温度为35℃,最适pH为4.0。在15～35℃、pH为6.0～9.0范围内,酶活保持相对稳定。NH2OH·HCl和KCN对酶活的抑制作用分别达到88%和57%,而NaN3对酶活的抑制作用只有15 %左右。Ca2+、Mn2+和Fe3+对其活性有增强作用,但是Hg2+和Zn2+却有中等的抑制作用。KCN和NH2OH·HCl抑制其酶活性分别达57%、88%,而NaN3的抑制率仅为15%。吸收光谱显示该酶在406nm处有一个Soret峰,加入1mmol/L Na2S2O4后,吸光度出现了明显的下降,但Soret峰没有显著移动。

发酵优化绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO高产吩嗪-1-羧酸

对绿针假单胞菌GP72-ND3ΔphzO的发酵条件进行优化并在5 L反应器中进行放大培养。在摇瓶水平通过单因素实验、正交实验、最陡爬坡实验和中心组合设计实验,优化得到最佳培养基组成为甘油49.55 g/L、大豆蛋白胨37.34 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO_(4)0.75 g/L、K 2 HPO_(4)0.225 g/L,发酵60 h后吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的最大产量为(6.01±0.17)g/L,是优化前的2.6倍。在1 L反应器中优化发酵pH,当培养过程pH值维持在6.8时,PCA的产量最高,为(7.16±0.04)g/L,是优化前的1.2倍。在最优培养基和pH条件下,对菌株在5 L反应器中进行放大培养,发酵60 h后PCA的最大产量为(6.84±0.53)g/L。研究为提高PCA的生物合成速率和工业化应用提供支持。

香茅醇假单胞菌SJTE-3的短链脱氢酶SDR-X1的克隆及酶性质测定

香茅醇假单胞菌SJTE-3能够以17β-雌二醇为唯一碳源并将其高效降解,但其催化雌二醇转化的关键酶仍不明确。本文鉴定了该菌株中降解雌二醇的短链脱氢酶SDR-X1(WP_043267487.1),并对其功能进行了研究。首先利用荧光定量PCR,检测了不同碳源条件下基因sdr-x1的转录水平;克隆基因sdr-x1,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,利用亲和层析纯化获得了重组蛋白SDR-X1;体外检测了重组蛋白SDR-X1的催化活性与酶学性质,并利用高效液相色谱鉴定了其转化17β-雌二醇的产物。蛋白SDR-X1可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对显示蛋白SDR-X1含有短链脱氢酶的保守基序与氨基酸。该酶以NAD+为辅因子,将17β-雌二醇氧化为雌酮;其K_(m)值为(0.03986±0.004061)mmol/L,V_(max)值为(3.168±0.135)mmol/L/min/mg,可在15 min内转化61.75%以上的雌二醇。该酶对温度具有一定耐受性,最佳反应温度为50℃,偏碱性pH可促进其酶促反应。不同二价金属离子对该酶活性具有不同的影响,Mg^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)可增强其酶活性。香茅醇假单胞菌SJTE-3中的SDR-X1可高效催化17β-雌二醇转化,参与该菌株的雌激素降解过程,其功能研究将推进细菌的雌激素代谢机制解析。