假型病毒载体研究进展

假型病毒是包被其它囊膜病毒糖蛋白的病毒颗粒。由于假型病毒具有宿主嗜性广、生物安全性高和稳定性强的优点,所以成为基因治疗中向靶细胞呈递治疗基因的有效工具,引起了广泛关注。假型病毒载体将会给基因治疗研究带来新的机遇。因此,将就假型病毒载体的最新研究进展作以综述。

假型病毒的应用研究进展

一种病毒的核酸被另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,称为假型病毒。假型病毒在细胞内只能进行单一周期复制,安全性好,并具有广泛的宿主范围,更高的转染效率,更容易浓缩成高滴度,能抵抗血清补体的攻击,非细胞周期依赖性地高效转染静止细胞等优点,因而假型病毒在研究病毒进入过程、受体鉴定、中和抗体检测、疫苗评价等方面具有重要作用。

应用于抗体中和试验的假型化新型冠状病毒的构建

目的构建基于HIV的假型化新冠病毒用于替代野生型病毒,降低实验室生物安全风险。方法从新冠病毒武汉类似株病毒RNA中扩增获得全长刺突蛋白基因,经密码子优化、C末端截短等改善刺突蛋白表达;同时,通过转染等包装条件优化,获得高滴度假型化新冠病毒。按照相同方法,获得Delta和Omicron变异株的假型化病毒。结果成功建立基于HIV包装系统的新冠病毒假型化系统,抗体中和试验表明,所构建的3种(武汉株、Delta、Omicron)假型化病毒与相应的野生型病毒的中和试验结果具有较好的一致性和相关性。结论本研究构建的假型化病毒可用于替代野生型病毒用于新冠病毒抗体中和试验。

3种对虾病毒囊膜蛋白对假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响

为探究对虾白斑综合征病毒(WSSV)3种囊膜蛋白VP19、VP24和VP28对其假型昆虫杆状病毒的包装与对虾组织亲嗜性的影响,本研究首先分析了过表达的上述3种囊膜蛋白在包装细胞(Sf9)中的亚细胞定位,然后通过共转染的方法分别构建了其假型杆状病毒:Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28,比较了上述3种假型杆状病毒的包装效率及其在感染对虾组织上的特异性。结果表明,过表达的VP19、VP24和VP28均可定位于包装细胞的细胞膜上,均能促进假型病毒的包装效率,并分别提高了14.1%、11.5%和11.7%,且携带不同囊膜蛋白的假型病毒在感染对虾成体时具有不同的最低感染剂量和不同的组织特异性。其中,假型病毒Bacmid-GUS/VP19和Bacmid-GUS/VP24仅能感染对虾成体的心脏和肌肉组织,且在单个对虾肌肉组织中两者的最低感染剂量分别为1×1011、1×108个具有生物活性的病毒颗粒数。而假型病毒Bacmid-GUS/VP28不仅能感染对虾的心脏和肌肉组织,还能感染对虾的鳃组织,且其在单个对虾鳃组织中的最低感染剂量为1×108个转导单位,在单个对虾肌肉组织中的最低感染剂量为1×109个转导单位。病毒感染对虾的成体组织的电镜分析结果提示,同哺乳动物细胞中的感染结果相似,假型昆虫杆状病毒在对虾成体组织中的感染也是复制缺陷的。本研究成果拓展了人们对于对虾WSSV病毒囊膜蛋白的生物学功能的认知,为假型昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统的构建及其在对虾活体基因转移中的应用提供指导。

整合猪瘟病毒囊膜蛋白的假型鼠白血病病毒感染性的研究

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV)的E0、E2和E012基因并进行了克隆与鉴定。构建了真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012,通过与鼠白血病病毒(MuLV)假型病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111瞬时共转染人胚肾细胞(293T),48h后收集假型病毒上清液,将假型病毒上清液超速离心后用抗CSFV的多抗进行Western-blot检测。结果证明E012蛋白能够在假型病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到此病毒粒子表面;用其感染多种宿主细胞,48h后检测发现在猪肾细胞(SK6,PK15)和猪睾丸细胞(ST)上,标记基因LacZ能有效表达,证实构建的CSFV假型病毒具有感染性。

表达猪瘟病毒E2蛋白的复制型水疱性口炎假病毒的拯救

为拯救囊膜表面携带有猪瘟病毒E2蛋白的复制型水疱性口炎假病毒,共转染分别表达水疱性口炎病毒核衣壳蛋白、磷蛋白、聚合酶蛋白以及携带有猪瘟病毒E2基因的复制型水疱性口炎病毒载体于BHK-21细胞中。采用Western blot、间接ELISA以及体外微量中和试验检测和鉴定拯救的假病毒。结果显示,E2蛋白成功地在BHK-21细胞中表达,假病毒VSV/CSFV-E2免疫的Balb/c小鼠血清中有高滴度的抗E2抗体,假病毒诱导产生的抗体在体外可以有效的阻断猪瘟病毒囊膜蛋白E1和E2蛋白假型的病毒HIV-luc/CSFV-E1&E2对PK-15细胞的感染。

假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染

目的构建假型逆转录病毒载体MuLV／VSV-G，并用于转染兔平滑肌细胞，为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体。方法构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV／VSV—G，测定滴度，并转染兔平滑肌细胞，观察其转导效率。并与MuLV的转导效率进行比较。结果构建的MuLV／VSV-G载体，病毒滴度为6～7．8×10^6CFU，转染兔平滑肌细胞的效率是（92±12）％。而MuLV的转导效率为（24土5）％。结论成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV／VSV-G载体，该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染。

假型逆转录病毒载体介导的tPA转染对平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨假型逆转录病毒载体VSV-G/MuLV介导组织纤溶酶原激活物(tPA),lacZ基因转染兔平滑肌细胞(SMCs)后基因的表达和对SMCs增殖的效应.方法:利用携带tPA,lacZ基因的假型逆转录病毒载体VSV-G/MuLV分别转染兔SMCs(SMCs/tPA,SMCs/lacZ).通过检测tPA抗原和测定tPA的活性观察tPA基因的表达.通过x-gal染色检测β-gal的活性测定lacZ基因的表达.用放射性标记的脱氧胸腺嘧啶苷(3H-TdR)掺入法和细胞计数法测定SMCs的增殖.结果:在没有纤溶酶原时,SMCs/tPA与SMCs在增殖上无显著差异.在有纤溶酶原时,SMCs/tPA条件培养基诱导了SMCs增殖.结论:VSV-G/MuLV介导tPA,lacZ转染到SMCs并成功表达.tPA基因转染在纤溶酶原存在的条件下促进了SMCs的增殖.

假型逆转录病毒高效介导人乳腺癌细胞基因转移

目的 :探索假型逆转录病毒MuLV/VSV G在乳腺癌细胞基因转导的效率 ,为乳腺癌细胞基因转导找寻一种高效的载体。方法 :将含报道基因的假型逆转录病毒MuLV/VSV G转导入人乳腺癌MDA MB 435细胞 ,观察其转导效率 ,并与MuLV的转导效率进行比较。结果 :MuLV/VSV G的转导效率达 (92± 12 ) % ,MuLV的转导效率为 (2 4±5 ) % ,前者较MuLV转导效率提高 3.8倍。结论 :假型逆转录病毒MuLV/VSV G可作为一种高效的载体广泛应用于乳腺癌的基因治疗研究。

表达鸡传染性支气管病毒S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白.

双表达H9N2禽流感病毒HA基因的假型重组杆状病毒系统的构建

以含有H9N2禽流感病毒HA基因的重组质粒pMD18-H9HA为模板,扩增HA基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将含有H9HA及gp64的基因片段克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA-H9-HA.然后将含有CMV启动子、H9HA及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBac-G,得到重组质粒pFastBac-G-H9-HA.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-G-H9-HA.利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-Dual-H9-HA.间接免疫荧光实验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达HA蛋白.免疫电镜观察结果表明,HA蛋白可以在该重组杆状病毒表面展示.

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果：PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论：实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒（PERV）的抑制作用奠定了基础。

埃博拉假病毒小鼠攻毒模型的建立与评估

埃博拉病毒具有极大的危险性,对其活病毒相关的操作必须严格限制在生物安全四级实验室(BSL-4)中,阻碍了疫苗和治疗药物的研发进程。本研究将扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)膜表面糖蛋白(GP)表达质粒与携带荧光素酶报告基因的pNL4-3.Luc.R-E-慢病毒载体共转染至HEK293T细胞,包装HIV骨架的EBOV GP-Fluc假病毒颗粒,建立了BSL-2条件下基于假病毒和生物发光成像(BLI)技术的BALB/c小鼠EBOV感染模型,并通过不同给药时间、途径和抗体种类的系统评估对其可靠性进行了验证。腹腔注射包含GP全长的假病毒在第4d可检测到集中于胸腺部位的最大发光信号,测试抗体在预防性静脉给药时可完全阻断假病毒的感染,在暴露后腹腔给药时表现出与其在活病毒小鼠模型中一致的保护效力。该模型为埃博拉病毒以及类似烈性病原体防治药物研发提供了一种简单有效的前期筛选方案。

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。

VSV-G假型反转录病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在新生血友病B小鼠中的有效转移和表达

研究探索了 ＶＳＶ－Ｇ假型反转录病毒 ｉｎ ｖｉｖｏ途径基因治疗血友病Ｂ的可行性．采用新型包装细胞 系 ２９３－ＧＰＧ制备了 ＶＳＶ－Ｇ／ＧＩＮａＢＡⅨ假型病毒，该病毒的最高滴度可达 ８．５ × １０～８ ＣＦＵ· ｍＬ～（－１），与传 统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应（Ｐ＜０．００１），并初步证实了新生鼠血清补体对ＶＳＶ－Ｇ假 病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体（Ｐ＜０．０１）．不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病Ｂ 鼠后，各治疗组小鼠血浆均可持续检测到 ｈＦⅨ抗原，最高峰值为（７２．５±６．１） ｎｇ·ｍＬ～（－１），表达持续超过 １２０ ｄ．治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善，以大剂量治疗组的改善最为明显，凝血活性提高 至（３．４± １．５）％， ＡＰＴＴ时间缩短至（４３．６± ７．２）ｓ． ｈＦⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂 量呈正相关．治疗小鼠体内未检测到抗ｈＦⅨ抗体，未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因 转移．研究结果表明，采用 ＶＳＶ－Ｇ假型反转录病毒开展新生血友病 Ｂ 小鼠 ｉｎ ｖｉｖｏ基因治疗是可供选择 的有效方法．

整合缺陷型重组慢病毒载体构建及HCV重组假型慢病毒颗粒的制备与性状分析

为提高慢病毒载体应用的安全性及改进HCV新型颗粒疫苗的制备,首先对传统的慢病毒三质粒系统进行改造:将包装质粒pHR’CMVΔR8.2改造成整合缺陷型的包装质粒pHR’CMVΔR8.2D64E,并在体外感染实验验证其整合缺陷性;将转移质粒中的报告基因GFP替换成HCV的NS3基因,选用表达3种亚型(1a、1b、2a)HCV包膜E1E2的包膜质粒,用改造后的三质粒系统制备了3种亚型(1a,1b,2a)的假型丙型肝炎病毒(HCV)整合缺陷型慢病毒颗粒,并用Western blot方法确定了颗粒上包膜蛋白的表达,通过电镜可观察到浓缩后的HCV慢病毒颗粒结构,HCV慢病毒颗粒感染Huh7细胞后可观察到转基因NS3的表达。为安全高效的慢病毒载体的应用及HCV假型颗粒疫苗研发提供了新的技术路线。

稳定表达T7RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

利用PCR从!溶原性细菌DE3中扩增出T7RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pT7BABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.1a-c(+)中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.

心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性研究

目的探索心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性。方法采用改良的差速贴壁法培养乳鼠心肌成纤维细胞并加以鉴定;利用携带新霉素抗性基因(neor)的假型逆转录病毒载体(VSV-G/MuLV)转导培养的乳鼠心肌成纤维细胞,用G418筛选法观察基因转导效果。结果成功建立高纯度心肌成纤维细胞培养模型;转基因后的心肌成纤维细胞经G418筛选后2周左右见大量克隆形成。结论假型病毒载体成功介导neor基因转导入心肌成纤维细胞,表明心肌成纤维细胞有望成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。

转tPA基因血管内皮细胞的功能表达

目的 观察组织型纤溶酶原激活剂（tPA）基因转导血管内皮细胞后的功能表达。方法 利用携带tPA基因的假型逆转录病毒转导血管内皮细胞株ECV304，用G418筛选法观察基因是否成功转导，采用发色底物显色法检测转基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性变化。结果 转tPA基因后的血管内皮细胞经G418筛选后2周左右见大量克隆形成；转tPA基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性在转导24h后增高，48h后增高更明显，72-96h浓度达高峰。结论 假型逆转录病毒载体成功介导tPA基因转导血管内皮细胞，并呈有效功能表达，为心血管手术后预防血栓形成的基因治疗提供实验依据。

表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

为了构建携带e GFP标签并表达马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)囊膜糖蛋白(GP)的复制型水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis v,iVrSuVs)假型病毒,通过将VSV感染性克隆全长质粒中的G基因替换成马尔堡病毒的GP基因,与4个辅助质粒p3.1-VSV-N、p3.1-VSV-P、p3.1-VSV-L、p3.1-VSV-G共转染BSR细胞,拯救成功的重组VSV病毒传5代后,进行Western-blot、间接免疫荧光试验、RT-PCR鉴定和生长动力学曲线检测。显微镜检测结果显示,3个重组全长质粒分别与4个辅助质粒共转染BSR细胞培养48 h后均能使细胞发生合胞体病变并伴有绿色荧光蛋白表达;Western-blot、间接免疫荧光试验鉴定结果显示,3株马尔堡病毒的囊膜糖蛋白在重组VSV病毒中正确表达;生长动力学曲线显示,3株重组VSV病毒的毒力相较于母本VSV病毒均降低,但病毒滴度依旧能达到1×10^(6)~1×10^(7)TCID_(50)mL^(-1)。结论:本研究成功构建3株携带e GFP标签表达MARV GP的复制型VSV假型病毒,为后续MARV疫苗与抗体的效果评价等奠定了基础。