重组杜氏利什曼原虫Pxn1、TryP、假定蛋白CAJ07026和GDPMP蛋白刺激BALB/c小鼠的免疫应答状态

目的观察重组杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)过氧化物还原酶1(peroxidoxin-1,Pxn1)、锥虫氧化还原过氧化物酶(tryparedoxin peroxidase,Try P)、假定蛋白CAJ07026(hypothetical protein CAJ07026.1,Hyp07026)和甘露糖-1-磷酸胍氨酸转移酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GDPMP)蛋白刺激BALB/c小鼠免疫应答状况。方法逆转录PCR(RT-PCR)分别扩增杜氏利什曼原虫Pxn1、Try P、Hyp07026和GDPMP编码基因,克隆入质粒p QE30,构建重组质粒p QE30-Pxn1、p QE30-Try P、p QE30-Hyp07026和p QE30-GDPMP,转化至大肠埃希菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用NTA-Ni盐凝胶层析柱,自然条件方式纯化重组蛋白rPxn1和rTry P,变性条件方式纯化重组蛋白rHyp07026和rGDPMP。25只BALB/c小鼠随机均分成5组,即rPxn1、rTry P、rHyp07026、rGDPMP免疫组及PBS对照组,免疫组小鼠分别以相应重组蛋白进行免疫,第1周免疫组小鼠皮下注射100μg相应的重组蛋白,隔周以50μg相应的重组蛋白加强免疫3次,对照组小鼠注射等量PBS。第3次加强免疫后1周,将各组小鼠脱颈处死,制备单个脾细胞,提取抗原刺激后小鼠脾细胞总RNA,用q RT-PCR微阵列检测抗原刺激后小鼠脾细胞内反映免疫应答的细胞因子转录水平表达谱。结果Pxn1、Try P、Hyp07026和GDPMP编码基因经PCR扩增,其产物大小分别为570、610、1 040和1 200 bp;经测序证实,与Gen Bank中的相关序列一致。重组质粒p QE30-Pxn1、p QE30-Try P、p QE30-Hyp07026和p QE30-GDPMP经IPTG诱导后均可在大肠埃希菌内高效表达,rGDPMP、rPXNT1、rTXNT和rHyp07026蛋白相对分子质量(Mr)分别为45 000、22 000、23 000和38 000。rGDPMP、rPXNT1、rTXNT和rHyp07026免疫小鼠的脾细胞内84个细胞因子基因的m RNA表达中,与PBS对照小鼠脾细胞比较,高水平表达的IL-1f6分别是对照组的96.22、271.54、108.51和250.15倍,IL-17f分别是对照组的105.54、35.71、53.38和53.57倍,IL-10分别是对照组的21.68、27.51、24.45和2.91倍。低水平表达的IL-4分别是对照组的5.74、2.43、1.59和0.71倍,IL-12β分别是对照组的0.05、0.26、0.10和0.50倍,IL-18分别是对照组的0.12、0.21、0.13和0.04倍,IFN-γ分别是对照组的3.59、0.39、0.29和0.63倍。结论杜氏利什曼原虫重组蛋白rPxn1、rTry P、rHyp07026和rGDPMP可刺激小鼠炎症反应及诱导免疫抑制。