人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化

人乳头瘤病毒假病毒可广泛应用于中和抗体鉴定和疫苗免疫性评估等研究.本研究对多质粒共转染293FT细胞生产HPV假病毒的方法进行了深入优化,结果显示不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒生产效率有显著的影响,HPV主要结构蛋白L1的表达水平是影响生产效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的生产,而报告质粒的用量对假病毒生产效率的影响相对较小.综合比较显示,在该体系中L1和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(如1∶1/10∶1/2)进行共转染可获得更为理想的生产效率.本研究同时也在293FT细胞中对磷酸钙转染方法进行了优化,通过磷酸钙与质粒用量的交叉配比试验获得了较优的转染条件.通过优化,建立了更为高效的HPV假病毒大量制备方法,在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒生产中的应用结果显示较原方法可显著提高生产效率.本研究为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件.

质粒转染比例对人乳头瘤病毒16/18型假病毒制备的影响

高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持续感染与宫颈癌、阴道癌、口腔癌等恶性疾病的发生相关,目前主要通过基于L1蛋白的HPV疫苗进行预防。而假病毒(Pseudovirus,PsV)的高效稳定生产是相关预防性疫苗免疫保护性评价的重要环节。为初步探究PsV生产过程中各质粒的配比关系对不同型别PsV制备的影响。本实验采用人乳头瘤病毒的16型(HPV16)和18型(HPV18)两种型别的相应质粒转染细胞,编码L1蛋白的质粒转染质量固定为10μg,分别改变编码L2蛋白质粒与EGFP报告质粒的转染比例,通过计算PsV的TCID50值、测定L1蛋白含量以及PsV的感染率对不同质粒转染配比下的假病毒进行评估。结果显示在HPV16PsV模型中,L1与L2转染质量比为10μg∶2μg时,可以得到TCID50较高的PsV,而当HPV18 PsV达到最大TCID50时,L1与L2的配比为10μg∶1μg,其TCID50略大于10μg∶2μg组;L1与L2比例为10μg∶2μg时两种PsV皆可达到最大感染率;PsV模型对EGFP配比变化并不如L2敏感,L1与EGFP质量比在0.5~1之间时两种PsV均可获得较高TCID50,然而EGFP配比改变造成的感染率差异并不具有统计学意义。本研究探究了HPV16、HPV18 PsV生产的一般规律,为其他型别PsV高效生产提供指导,继而为疫苗保护性评价及结构生物学样品制备奠定基础。

高致病性H5N8亚型禽流感假病毒的制备与验证

目的为研究高致病性H5N8亚型(A/Astrakhan/3212/2020)禽流感病毒的结构,制备相应假病毒,并对其在细胞水平上的感染能力以及血清抗体的中和能力进行初步验证。方法通过对H5N8亚型病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的氨基酸序列分析,将目的HA和NA序列进行优化并提取相应质粒,采用慢病毒包装系统制备H5N8亚型假病毒;使用感染含有α-2,6唾液酸受体的293T-ST6GAL1细胞后的荧光素酶读值、血凝抑制试验、透射电镜以及血清中和试验对制备的假病毒进行验证。结果成功制备H5N8亚型假病毒,其对293T-ST6GAL1细胞的感染力为103TCID50/m L,浓缩50倍后血凝活性从16提高到128,透射电镜可观察到典型的流感病毒颗粒,中和试验显示3份H5N8阳性血清中和活性明显高于其他亚型阳性血清以及阴性血清。结论成功制备高致病性H5N8亚型禽流感假病毒,为未来的疫苗开发和中和抗体筛选提供了重要的实验平台。

H7N9亚型禽流感假病毒的制备与验证

根据A/Anhui/1/2013(H7N9)病毒株HA和NA基因序列研究H7N9禽流感病毒的结构并制备相应的假病毒,并对此假病毒进行初步验证。将H7N9病毒株的HA和NA基因序列经公司优化合成后,经过接菌、提取质粒、假病毒构建等步骤来制备假病毒,并通过假病毒感染实验、透射电镜以及血清中和实验来验证假病毒制备是否成功。成功制备滴度均超过标准值104的A/Anhui/1/2013(H7N9)假病毒,在电镜下可观察到典型的流感病毒形态,并进一步使用本科室保存的29份血清样本(含4份H7N9阳性血清样本)、国家流感中心制备的四种不同亚型免疫组分(H1型、H3型、BV型和BY型)的抗血清以及商品化H7N9特异性抗体进行中和试验,结果显示4份阳性血清中和活性明显高于25份阴性血清,四种不同亚型抗血清的中和效率均低于40%,且商品化H7N9特异性抗体能够与其有效结合。本研究成功构建了H7N9假病毒并有效筛选出阳性血清,且具有良好的特异性,为流感大流行或疫苗免疫后人群血清学监测建立了科学有效的技术手段。