假肥大型肌营养不良基因携带者检测方法的研究进展

假肥大型肌营养不良 (DMD)在儿童神经肌肉系统疾病中发病率高 ,预后差 ,目前尚无有效的治疗方法 ,故携带者的检出对预防患儿出生具有重要意义。传统的检测方法漏诊率高 ,使用有限 ,近年来在基因检测方面取得了一定进展。文章主要介绍假肥大型肌营养不良基因携带者的基因检测方法 。

DMD基因c.2622+2T>C导致假肥大型肌营养不良的时空表达特异性分析

目的:对一例假肥大型肌营养不良(DMD)患儿进行基因变异分析,探究基因型和临床表型的相关性。方法:采集家系成员的临床数据和家族史,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测目标基因拷贝数变异是否异常、全外显子组测序(WES)分析先证者致病基因、Sanger测序验证可疑位点。针对发现的剪切位点突变构建mini-gene表达载体,采用mRNA体外剪接mini-gene实验验证变异对mRNA剪切的影响。结果:该家系先证者男,双下肢无明显受累,外周血肌酸激酶(CK)水平升高(700-1600U/L),肌电图示肌源性损害。MLPA检测未发现受检者DMD基因存在外显子拷贝数变异。测序结果显示先证者携带DMD基因(NM_004006.2)c.2622+2T>C母源剪切变异。体外mini-gene实验发现该变异影响剪切且产生多种新转录本。结合患儿临床表现及基因检测结果,推测受检者为DMD基因剪切变异导致的假肥大型肌营养不良。结论:本研究明确了DMD基因剪切变异为一例DMD患儿致病原因,进一步丰富了中国DMD突变谱,证实了DMD基因c.2622+2T>C变异可产生多种转录本导致不同的功能受损,对患者临床表现与基于时空表达相关联,有一定的基因型-表型对应关系的参考意义。

贵州地区假肥大型肌营养不良60例临床特征分析

目的 了解贵州地区假肥大型肌营养不良患者临床特征,为该类疾病的诊断及治疗提供理论依据。方法 收集60例因双下肢乏力、步态不稳、行走困难、运动发育落后、肝酶异常、肌酶异常就诊且基因检查确诊为假肥大型肌营养不良的患儿,整理其临床资料,分析这些患者临床表型特征。结果 60例假肥大型肌营养不良患者平均起病年龄为2岁10月,其中包括2例女性患者及58例男性患者;从起病至确诊,平均诊断耗时25.4月,耗时较长的原因主要为家属认识不足或基层医院诊断为肝酶、心肌酶异常原因导致延迟就诊;60例患儿实验室检查指标均表现出谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶增高,肌酸激酶同工酶/肌酸激酶小于0.07;结论 贵州地区假肥大型肌营养不良诊治现状不容乐观,需加强该类疾病的科普宣传及临床诊疗培训;在临床实践中,对于实验室指标发现不明原因谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶增高,同时肌酸激酶同工酶/肌酸激酶小于0.07的患者,应考虑假肥大型肌营养不良;对于临床考虑假肥大型肌营养不良患者,应积极完善基因检测。

贵州地区假肥大型肌营养不良60例临床特征分析

目的 了解贵州地区假肥大型肌营养不良患者临床特征,为该类疾病的诊断及治疗提供理论依据。方法 收集60例因双下肢乏力、步态不稳、行走困难、运动发育落后、肝酶异常、肌酶异常就诊且基因检查确诊为假肥大型肌营养不良的患儿,整理其临床资料,分析这些患者临床表型特征。结果 60例假肥大型肌营养不良患者平均起病年龄为2岁10个月,其中包括女2例、男58例;从起病至确诊,平均诊断耗时25.4个月,耗时较长的原因主要为家属认识不足或基层医院诊断为肝酶、心肌酶异常原因导致延迟就诊;60例患儿实验室检查指标均表现出谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶增高,肌酸激酶同工酶/肌酸激酶<0.07。结论 贵州地区假肥大型肌营养不良诊治现状不容乐观,需加强该类疾病的科普宣传及临床诊疗培训;在临床实践中,对于实验室指标发现不明原因谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶增高,同时肌酸激酶同工酶/肌酸激酶<0.07的患者,应考虑假肥大型肌营养不良;对于临床考虑假肥大型肌营养不良患者,应积极完善基因检测。

假肥大型肌营养不良症产前基因诊断的临床应用

目的 建立规范的假肥大型肌营养不良症 (DMD/BMD)产前基因诊断程序。方法 利用DMD基因内 18个缺失热点的PCR引物 ,6个DMD基因内 (CA)n短重复序列 (STR)引物以及性别决定基因SRY引物 ,多重聚合酶链反应检测羊水胎儿脱落细胞、先证者和双亲外周血有核细胞基因组DMD基因 ,通过胎儿性别确定、基因缺失检测和基因连锁分析确定胎儿DMD基因状态。结果 在 4例先证者基因缺失家系的产前诊断中 ,2例男胎DMD基因缺失与先证者相同 ,1例女胎为基因缺失携带者 ,1例男胎未发现缺失 ;在 4例有 2个或 2个以上患者且先证者未检出缺失的家系产前诊断中 ,发现获得风险染色体的男胎与女胎各 1例 ,余1例女胎和 1例男胎均未携带风险染色体。检测结果的可靠性经流产胚胎和已出生胎儿DNA分析、DMD临床症状监测得到部分证实。结论 胎儿性别基因诊断、DMD基因缺失检测结合基因连锁分析的方法 ,在严格控制检测范围、规范的检测程序和有效的质量控制下 ,能准确地对DMD/BMD进行产前基因诊断 。

第二代测序技术检测1例假肥大型肌营养不良家系Dystrophin基因突变

目的探讨第二代测序(NGS)技术检测假肥大型肌营养不良患者的可行性。方法用NGS技术检测1例假肥大型肌营养不良(DMD)患者,并用Sanger测序技术对患者基因型进行验证,同时检测家系其他成员基因型。结果 NGS技术结果表明,该患者DMD基因编码区第55号外显子存在1个移码突变c.8087delT(p.Leu2696ArgfsX30),为致病性突变;同时该患者还存在3个错义突变p.Arg2937Gln、p.Arg1745His和p.Asp882Gly,均为已知多态性变异;Sanger测序技术进一步证实了该点突变的存在,同时发现患者母亲为该突变的携带者,患者父亲和妹妹未见该突变。结论 NGS技术可用于DMD基因突变检测,为DMD临床遗传咨询和治疗提供了依据。

假肥大型肌营养不良患儿的血清酶学与基因特征分析

目的分析假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)患儿的血清酶学与基因特征,提高对本病的认识及诊断水平。方法对118例临床诊断为DMD/BMD的患儿进行血清酶学(ALT、AST、LDH、CK、CK-MB、MB、HBDH)与基因检测结果分析。结果所有患儿的血清酶学结果明显高于正常对照组儿童(均P <0.001),学龄前患儿的CK和CK-MB水平明显高于学龄期患儿(均P <0.01);118例患儿中DMD基因检测阳性结果 91例,阴性结果患儿中8例接受基因测序检查,其中6例检出突变;CK、CK-MB及两者联合应用时预测患儿基因诊断阳性的曲线下面积分别为0.74、0.69和0.79。结论血清酶学检测对DMD/BMD筛查具有简便快速、经济可行、依从性好的优点,CK和CK-MB可作为基因诊断预测的指标;而基因检测可明确致病基因,为遗传咨询与未来可能的基因治疗提供依据。

假肥大型肌营养不良一个核心家系DMD基因分析

目的对临床诊断的假肥大型肌营养不良1例患儿进行基因诊断,同时进行携带者筛查。方法采用目标区序列捕获及第2代高通量测序技术对假肥大型肌营养不良患儿进行检测,同时采用Sanger测序技术对患者及其父母的基因型进行验证。结果发现患儿DMD基因第45外显子存在1个纯合无义突变c.6589A>T(P.Lys2197X),患儿母亲为杂合突变携带者。结论本研究发现了一个尚未报道的致病性基因突变位点,同时发现第2代测序技术可以快速准确检测出DMD基因的点突变,具有一定的临床应用价值,为遗传咨询提供准确信息。

假肥大型肌营养不良症基因诊断研究I．Dystrophin基因5’区域缺失分析

用ＤｙｓｔｒｏｐｈｉｎｃＤＮＡ亚克隆ｃＤＭＤ１－２ａ和ｃＤＭＤ２ｂ－３为分子杂交探针，以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法，对６０例无亲缘关系假肥大型肌营养不良症（ＤＭＤ／ＢＭＤ）患者ＤＭＤ基因５’区域的分子结构进行研究，发现１２例病人在此区域存在着位置、范围不同的缺失突变。其中４例ＢＭＤ显示整码缺失突变，５例ＤＭＤ显示移码突变，另３例ＤＭＤ有大范围的分子缺失。

假肥大型肌营养不良的分子生物学和基因诊断

假肥大型肌营养不良（Ｄ／ＢＭＤ）是一种等位基因Ｘ－连锁隐性遗传病，本文综述了Ｄ／ＢＭＤ基因的定位、结构、突变 和致病机理，并重点阐述了目前对Ｄ／ＢＭＤ携带者检测和产前诊断几种基因诊断方法的适用范围和各自的优缺点。

基因测序结合STR连锁分析在假肥大型肌营养不良症产前诊断中的应用

目的假肥大型肌营养不良症(Duchenne/Becker muscular dystrophy(DMD/BMD)是一种X-连锁隐性致死性遗传病,尚无特异性治疗方法,建立一套适合于DMD基因点突变产前诊断及早期产前诊断的方法,为携带者产前诊断提供有效的基因诊断途径,以避免患胎的出生。方法 27例DMD基因点突变携带者妊娠期取绒毛组织或羊水进行风险胎儿的DMD基因测序、DNA-STR分型和性别基因检测。结果 27个风险胎儿中,检出DMD患胎6例,其中无义突变3例,移码突变2例,剪接位点突变1例;检出携带者胎儿8例,其中移码突变4例,无义突变3例,剪接位点突变1例;13例为正常胎儿。27例中11例是通过绒毛膜穿刺活检进行,其余为羊膜腔穿刺羊水检查。结论基因测序结合STR连锁分析用于用于DMD点突变的产前基因诊断是目前一种准确和可行的方法。可成功地避免患病胎儿的出生,并能明确区分DMD基因纯合子和杂合子突变,避免正常胎儿被错误淘汰。

假肥大型肌营养不良症患者HLA-A、B、DR基因表达研究

目的 研究南方假肥大型肌营养不良症 ( duchenne muscular dustrophy,DMD)患者 HLA-A、B、DR基因多态性 ,探讨免疫遗传因素在 DMD发病中的作用 ,并为临床骨髓移植提供基础性资料。方法 采用 PCR反向序列特异性寡核苷酸杂交技术与美国骨髓库编码软件 ( National marrow donorprogram,NMDP) ,对 2 9例 DMD患者 HLA-A、B、DR等位基因多态性进行研究。结果 DMD组 HLA-A2 4等位基因频率 9.0 3 % ,与对照组2 2 .1 6%相比有所降低 ( P =0 .0 1 7) ;DMD组 HLA-B1 3等位基因频率 1 6.95 % ,与对照组 6.75 %相比显著增高( P=0 .0 0 7)。但校正后 P值差异均无显著性 ( P值分别为 0 .2 5 5和 0 .2 3 1 )。结论 DMD患者 HLA-A、B、DR基因表达与正常对照组差异无显著性 ,HLA遗传易感性与 DMD发病无明显相关 ,但尚需要扩大样本量或进行高分辨加深研究。

假肥大型进行性肌营养不良症一个家族的基因诊断检测

目的:对一个假肥大型进行性肌营养不良症(beckermusculardystro-phy,BMD)家族中的女性和胎儿进行携带者和产前基因诊断。方法:用9对引物的多重PCR法和相关的3个内含子(45,49和50)的(CA)n多态性检测法诊断BMD患者dystrophy基因DNA缺失。结果:此BMD家族中先证者为45,48号外显子缺失,45,49和50号内含子缺失,一个妹妹为正常人,2个姐姐及母亲为携带者,男胎儿为正常胎儿。结论:多重PCR法和(CA)n多态性检测法联合应用可对有DNA缺失阳性的BMD家族中的女性和胎儿进行携带者和产前基因诊断检查。

假肥大型肌营养不良症的产前基因诊断

假肥大型肌营养不良症(duchenne musculardystrophy,DMD)又称进行性肌营养不良症,是我国最常见的X连锁隐性遗传性疾病之一.在活男婴中发生率为1/3 500,临床以渐进性加重的对称性肌肉无力,肌肉萎缩为特点,盆带肌最先受累.

荧光原位杂交技术在检测假性肥大型肌营养不良症缺失型携带者中的应用

目的:应用荧光原位杂交(FISH)筛查技术检测假性肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)缺失型携带者。方法:以外显子特异Cosmid DNA为探针(含18个外显子),采用中期和间期单色FISH技术,对9例正常男、女性及来自不同缺失型DMD/BMD家系的5例女性外周血标本、来自健康孕妇的2例羊水和2例绒毛标本进行分析。结果:72～100％外周血淋巴细胞中期相或间期核、60～70％羊水细胞间期核、95～99％绒毛细胞间期核显示预期信号。FISH检出1名、排除2名缺失型携带者。结论:充分利用FISH技术优点,结合现有其它技术,可有效筛查DMD/BMD缺失型携带者,并为女性胎儿DMD/BMD缺失型携带者产前诊断奠定基础。

假肥大型肌营养不良患者血清肌酸激酶变化规律

目的假肥大型肌营养不良患者血清肌酸激酶随病程进展而不断变化。该研究旨在分析假肥大型肌营养不良患者血清肌酸激酶的变化规律。方法收集临床已确诊的假肥大型肌营养不良患者的血清，其中男性39例，女性1例，通过连续监测法测定血清肌酸激酶。结果假肥大型肌营养不良患者血清肌酸激酶在3—5岁达到峰值，以后随病程进展和年龄增加逐年下降，年均下降率为8．7％。结论假肥大型肌营养不良患者的血清肌酸激酶在3—5岁达到峰值，以后随年龄增加而逐年下降，这种变化规律可以反映肌纤维坏死速率和病程进展速度，评估治疗效果。

异体骨髓干细胞移植后假肥大型肌营养不良症模型鼠膈肌dystrophin表达及病理改变

目的探讨骨髓干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)模型鼠-mdx鼠膈肌的治疗效果。方法取雄性SD大鼠骨髓干细胞经尾静脉植入放疗处理后的8周龄雌性mdx鼠(n=18)。于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行 HE染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫荧光检测以及dystrophin mRNA的RT-PCR分析,同时用正常C57鼠及放疗而未移植的mdx鼠作为对照,另进行PCR反应检测实验鼠膈肌内Sry(Y染色体的性别决定区)基因。结果移植后mdx 鼠膈肌间质内炎性细胞浸润较放疗而未移植mdx鼠有所减少;移植后核中心移位纤维比例[移植后4、8、12周分别为 (15．58±0．91)％、(12．50±1．87)％、(10．17％±1．17)％]较未移植mdx鼠(19．5±1．87)％显著减少。移植后dystrophin免疫荧光阳性细胞比例[移植后4、8、12周分别为(1．00±0．32)％、(6．00±1．05)％、(11．92±1．11％)]较未移植mdx鼠(O．17±0．41)％显著增加。RT-PCR结果显示C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相对含量(0．63±0．04)最高;而未移植mdx鼠的膈肌中未检测到dystrophin mRNA;移植后的mdx鼠膈肌中mRNA的表达水平(移植后4、8、12周分别为0．19±0．05、0．26±0.06、0．36± 0．04)随时间推移逐渐增高;移植后各时间点mdx鼠膈肌Sry基因均为阳性。结论骨髓干细胞系统移植mdx鼠可以恢复部分膈肌的dystrophin表达,改善膈肌的病理,骨髓干细胞移植有希望成为全身治疗DMD的有效方法。

假肥大型肌营养不良基因诊断研究进展

假肥大型肌营养不良[杜氏进行性肌营养不良(DMD)/贝氏进行性肌营养不良(BMD)]是最常见的X连锁隐性遗传性肌肉系统疾病,临床特征为进行性加重的对称性肌无力、肌萎缩和小腿腓肠肌假性肥大。DMD预后差,目前尚无治愈方法。抗肌萎缩蛋白基因(DMD基因)为致病基因,DMD基因庞大,突变类型多样,近年来DMD基因突变的检测技术已取得了一定的进展。本文就DMD基因诊断技术进展作一综述。