猪细小病毒检测ICC-qPCR替代方法的建立

目的:建立猪细小病毒(PPV)的细胞培养结合荧光定量PCR(ICC-qP CR)方法并进行优化,结合传统的病毒滴定(细胞培养法)及ICC-qP CR方法,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。方法:将系列10倍稀释的PPV病毒接种于猪睾丸(ST)细胞,分别扩增培养0、12、18、24 h,考察理想的病毒扩增培养时间,确定ICC-qP CR定量检测区间及获得病毒扩增倍数(K);将病毒平行接种于病毒扩增组及非扩增的对照组,通过扩增组和对照组的系列病毒接种量与PCR反应周期(Ct)值的拟合曲线,分别获得病毒扩增组及对照组的ICC-qP CR检测病毒滴度(T_(a)、T_(c)),结合扩增倍数(K),根据公式[Log_(10)(10^(Ta)-10^(Tc))/(K-1)]直接计算样本中的感染性病毒滴度。最后,将ICC-qP CR、优化ICC-qP CR方法和细胞培养法分别用于模拟样本(由不同比例感染性病毒和非感染性病毒组成)中的感染性病毒滴度测定,考察将其应用于病毒灭活验证研究的可行性。结果:PPV接种后的最佳扩增培养时间为24 h,检测下限为-1 LogL0~5.00 Logs_(10)TCID_(50)·100μL^(-1)(ogs),定量区间为,扩增倍数为83.11。当模拟样本中的非感染性病毒含量较低或与感染性病毒等量时,ICC-qP CR、优化ICC-qP CR方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度没有显著性差异;然而,当模拟样本中的非感染性病毒含量较高时,由优化的ICC-qP CR方法和细胞培养法测得的感染性病毒滴度分别是1.46、1.50 Logs,二者高度一致,而常规ICC-qP CR方法测得的结果(1.75 Logs)存在极显著性差异。结论:本研究所优化的ICC-qP CR方法作为细胞培养法的替代方法,具有用于病毒灭活验证研究的前景。