基于网络药理学、分子对接及实验验证探讨滋肾健脾化瘀片对糖尿病视网膜病变的干预机制

目的运用网络药理学方法和分子对接技术探讨滋肾健脾化瘀片(山萸肉、三七、黄芪、葛根、鸡血藤、生地黄)治疗糖尿病视网膜病变(DR)的作用机制,并通过体外实验进行验证。方法(1)利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及BATMAN-TCM数据库筛选滋肾健脾化瘀片的有效成分及其对应的靶点蛋白。利用GeneCards、OMIM及TTD数据库检索DR疾病相关靶点。利用VENNY 2.1.0平台对药物活性成分靶点与DR疾病相关靶点取交集(共同靶点),即为滋肾健脾化瘀片治疗DR的潜在作用靶点。构建“中药-活性成分-共同靶点”网络,筛选出滋肾健脾化瘀片治疗DR的关键活性成分。将共同靶点导入STRING数据库,获取PPI网络关系,并筛选出核心靶点。运用Metascape平台对共同靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。将关键活性成分及核心靶点通过Autodock 4软件进行分子对接验证。(2)制备滋肾健脾化瘀片含药血清及空白血清。将人视网膜微血管内皮细胞(HRmECs)随机分成5组:对照组(低糖DMEM培养基+10%空白血清)、高糖组(高糖DMEM培养基+10%空白血清)及滋肾健脾化瘀片含药血清低、中、高剂量组(高糖DMEM培养基+10%低、中、高剂量含药血清),培养48 h后进行检测。采用CCK-8法检测HRmECs细胞增殖活性;RT-qPCR法检测HRmECs细胞中IL-1β、AKT1、VEGFA、TP53 mRNA表达水平。结果(1)共筛选出滋肾健脾化瘀片治疗DR的潜在作用靶点(共同靶点)74个;9个关键活性成分包括槲皮素、芒柄花黄素、毛地黄黄酮、β谷甾醇、山柰酚、毛蕊异黄酮、γ-氨基丁酸、豆甾醇、异鼠李亭;12个核心靶点:IL-1β、PPARG、NOS3、CXCL8、IL-6、AKT1、TNF、INS、EGF、VEGFA、TP53、PTGS2。GO功能及KEGG富集分析显示核心靶点主要参与了炎症反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞迁移等生物过程,以及NF-κB信号通路、AGE-RAGE信号通路、HIF-1通路、TNF通路、PI3K-AKT通路等。关键活性成分与核心靶点均具有较好的结合亲和力。(2)与对照组比较,高糖组HRmECs细胞活性显著降低(P<0.01);细胞中VEGFA、TP53、IL-1βmRNA表达水平显著升高(P<0.01),AKT1 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。与高糖组比较,滋肾健脾化瘀片含药血清低、中、高剂量组的HRmECs细胞活性均显著升高(P<0.05,P<0.01),并呈浓度依赖性;含药血清高剂量组细胞的VEGFA、TP53、IL-1βmRNA表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),而AKT1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。结论滋肾健脾化瘀片可能通过槲皮素、山柰酚、毛地黄黄酮等多种活性成分,作用于IL-1β、IL-6、VEGFA等核心靶点,以及NF-κB信号通路、AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT通路等关键通路,从而发挥对DR的治疗作用。

滋肾健脾化瘀片对早期糖尿病肾病气阴两虚夹瘀证患者的疗效观察

【目的】观察滋肾健脾化瘀片对早期糖尿病肾病(DKD)气阴两虚夹瘀证患者的临床疗效。【方法】将77例早期DKD气阴两虚夹瘀证患者随机分为对照组38例和干预组39例。在基础治疗的同时,干预组予以滋肾健脾化瘀片治疗,对照组予以匹配的安慰剂治疗,疗程为12周。观察2组患者治疗前后中医证候积分、肾功能指标[尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR)、内生肌酐清除率(Ccr)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)]及血压[收缩压(SBP)、舒张压(DBP)]、血糖[空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)]、血脂[胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]等指标的变化情况,评价2组患者的临床疗效。【结果】(1)治疗12周后,干预组的总有效率为87.18%(34/39),对照组为42.11%(16/38),干预组的疗效明显优于对照组(P<0.05)。(2)治疗后,2组患者的中医证候积分均较治疗前明显降低(P<0.05),且干预组对中医证候积分的降低作用明显优于对照组(P<0.05)。(3)治疗后,干预组的ACR、Ccr及Cys-C水平较治疗前明显改善(P<0.05),而对照组的各项肾功能指标均无显著性改善(P>0.05);组间比较,干预组对ACR、Ccr及Cys-C水平的改善作用明显优于对照组(P<0.05)。(4)治疗后,干预组的FBG、HbA1c、TC、TG及LDL-C水平均较治疗前明显改善(P<0.05),而对照组的各项血糖、血压及血脂指标均无显著性改善(P>0.05);组间比较,干预组对FBG、HbA1c、TC、TG及LDL-C水平的改善作用明显优于对照组(P<0.05)。【结论】滋肾健脾化瘀片治疗早期DKD气阴两虚夹瘀证患者的疗效确切,可以有效降低患者的中医证候积分,改善肾功能,调节糖脂代谢。

滋肾健脾化瘀片联合激光治疗糖尿病性黄斑水肿的疗效观察

目的观察滋肾健脾化瘀片联合激光光凝治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)的疗效。方法 43例(86只眼)DME患者按数字随机表法分为激光组21例(42只眼)和联合组22例(44只眼),激光组予视网膜激光光凝治疗;联合组口服滋肾健脾化瘀片联合视网膜激光光凝治疗,疗程为3个月。结果视力:2组治疗后视力均有提高,治疗后激光组有效率为54.76%(23/42),联合组有效率为79.55%(35/44),联合组视力明显优于激光组,差异有统计学意义(P<0.05);OCT:2组治疗后黄斑中心小凹视网膜厚度及黄斑中心凹1 mm直径视网膜厚度平均值均较前改善,差异有统计学意义(P<0.05);FFA:激光组黄斑区荧光渗漏消失或减轻36只眼,有效率为85.71%(36/42),联合组相应的眼数为44只眼,有效率为100%(44/44),2组差异有统计学意义(P<0.05)。结论滋肾健脾化瘀片联合激光治疗比单纯激光光凝治疗DME疗效更好。

滋肾健脾化瘀片对糖尿病大鼠视神经组织的保护作用

目的通过观察滋肾健脾化瘀片对糖尿病大鼠视神经组织形态及超微结构的影响,探讨滋肾健脾化瘀片对糖尿病视神经的保护作用。方法通过建立链脲佐菌素诱导的SD大鼠DM模型,并用滋肾健脾化瘀片和导升明胶囊治疗,观察光镜下视神经组织形态的改变及透射电镜下视神经超微结构的改变。结果中药高剂量组的视神经光镜下视神经排列较导升明组及模型组明显整齐。视神经纤维退变和神经髓鞘脱失的程度均显明轻于导升明组及模型组。结论滋肾健脾化瘀片对糖尿病视神经有一定保护作用,能减轻实验性糖尿病大鼠视神经的病理损害。

滋肾健脾化瘀片对糖尿病大鼠早期视网膜超微结构的影响

目的观察病程为3个月的糖尿病大鼠神经及血管网膜超微结构的病理改变以及滋肾健脾化瘀片对其的影响。方法链脲佐菌素糖尿病大鼠随机分为模型组、导升明组、中药低剂量组、中药高剂量组,并设正常对照组,每日灌药1次,3个月后取后极部视网膜行消化酶铺片及透射电镜观察。结果糖尿病大鼠在3个月时视网膜血管出现管径粗细不均、排列紊乱、扭结和血管襻、未见微血管瘤,血-视网膜外屏障改变。神经网膜视细胞外节膜盘结构模糊,排列紊乱,肿胀变性,甚至溶解破坏。内节含有大量空泡样变的线粒体。内核层细胞内线粒体空泡样变增多。节细胞层核膜不连续、断裂,细胞核皱缩。中药组相对导升明组基底膜增厚减轻,血-视网膜外屏障紧密连接小带连接紧密,色素上皮的顶部微绒毛排列整齐;视细胞外节膜盘、内节线粒体、内核层及神经节细胞层都显示变性线粒体比例下降。结论病程3个月的糖尿病大鼠视网膜血管及神经网膜已出现病理改变,滋肾健脾化瘀片对糖尿病大鼠的视网膜血管及神经网膜具有保护作用,并能减轻血-视网膜外屏障的病理损害。

滋肾健脾化瘀片对非增殖型糖尿病视网膜病变患者视野及IL-6、TNF-α的影响

目的:观察滋肾健脾化瘀片对糖尿病视网膜病变(DR)患者视野及IL-6、TNF-α的影响,探讨滋肾健脾化瘀方的临床疗效及作用机理,评价其有效性。方法:收集非增殖型糖尿病视网膜病变(NPDR)患者53例,分为2组,治疗组23例口服滋肾健脾化瘀片治疗,对照组30例单纯内科降糖治疗。正常对照组20例。检测所有患者外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量,并行DR患者观察前后视野检查。结果:PDR组与正常对照组比较,IL-6、TNF-α升高,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗3月后,治疗组TNF-α与0月比较,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗3月后,治疗组IL-6与0月比较,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组0月、3月MS、MD、LV比较,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。3月时2组MS、MD比较,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。对照组3月自然病程中MS与0月比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:滋肾健脾化瘀片可以对DR患者提高MS、MD、LV;降低炎症因子TNF-α、IL-6的水平,减轻其对视网膜的损伤,从而改善视功能。

滋肾健脾化瘀片联合激光治疗糖尿病黄斑水肿近期与远期疗效观察

目的:观察滋肾健脾化瘀片联合532激光治疗糖尿病黄斑水肿(DME)的临床疗效。方法:将40例(40眼)DME患者随机分为光凝组20例(20眼)和联合组20例(20眼),光凝组采用单纯激光治疗,联合组采用中药联合激光治疗,2组疗程均为30天,观察2组治疗后2月末及4月末的近期及远期疗效。结果:2月末联合组的总有效率为100%,光凝组的总有效率为70.0%,2组比较,差异有非常显著性意义(P<0.01)。4月末联合组的总有效率为90.0%,光凝组的总有效率为60.0%,2组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:滋肾健脾化瘀片联合532激光治疗糖尿病黄斑水肿近期及远期疗效肯定,优于单纯激光治疗。

HPLC法测定健脾化瘀片中黄芪甲苷的含量

目的：建立高效液相色谱法（HPLC）测定健脾化瘀片中黄芪甲苷的含量。方法：采用高效液相色谱法,十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱,流动相：乙腈-水（35：65）;蒸发光检测器检测。结果：在1.00~10.05μg范围内黄芪甲苷峰面积与进样量线性关系良好,r=0.9997;样品加样回收率为99.67%（n=6）。RSD为0.43。结论：所建立的方法准确可行,重复性好,可有效控制健脾化瘀片的质量。

滋肾健脾化瘀片通过抑制AGEs/RAGE/NF-κB通路改善糖尿病大鼠的视网膜病变

目的探讨滋肾健脾化瘀片改善糖尿病大鼠早期视网膜病变的作用机制。方法将28只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组及滋肾健脾化瘀片高、低剂量(2.4、0.6 g·kg^-1)组。采用腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ,60 mg·kg^-1)建立糖尿病大鼠模型。灌胃给药(9.6 mL·kg^-1),每日1次,连续给药10周。采用HE染色法观察视网膜组织病理学变化,进行视网膜神经节细胞(RGC)计数;免疫组化法检测大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)、核因子κB(NF-κB)及糖基化终产物受体(RAGE)蛋白表达水平;ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、糖基化终产物(AGEs)水平。结果与空白组比较,模型组大鼠的视网膜神经节细胞层排列紊乱、内外核层水肿、空泡化改变并且视网膜的厚度变薄,RGC数量明显减少(P<0.05);视网膜VEGF、RAGE、NF-κB蛋白表达和血清AGEs、IL-1β、IL-6水平明显上调(P<0.05)。与模型组比较,滋肾健脾化瘀片高剂量组大鼠的视网膜层结构、排列以及水肿程度得到了一定改善,RGC数量明显增多(P<0.05),视网膜VEGF、RAGE、NF-κB蛋白表达和血清AGEs、IL-1β、IL-6水平明显下调(P<0.05);滋肾健脾化瘀片低剂量组大鼠的视网膜RGC数量亦明显增多(P<0.05),血清AGEs表达水平明显降低(P<0.05)。结论滋肾健脾化瘀片可改善糖尿病大鼠视网膜内、外核层的水肿情况,减少神经节细胞的丢失,其机制可能与抑制AGEs/RAGE/NF-κB通路来下调炎症因子的表达有关。

健脾化瘀片治疗2型糖尿病胰岛素抵抗患者65例临床研究

目的:探讨健脾化瘀片对2型糖尿病胰岛素抵抗患者在降糖、调脂、提高胰岛素敏感性等方面的作用。方法:入选病例为2型糖尿病伴高胰岛素血症,中医证属脾肾不足、痰瘀互结的患者。97例患者按2∶1比例随机分为治疗组(健脾化瘀片组)65例和对照组(二甲双胍片组)32例,均服药8周。结果:治疗组总有效率81.54%,对照组为59.38%,两组比较差异有显著性(P<0.05);降低空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白的总有效率,治疗组分别为81.54%、75.38%和70.77%,对照组分别为65.63%、50.00%和56.25%;提高胰岛素敏感指数的总有效率治疗组为78.46%,对照组为53.13%,两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:健脾滋肾化瘀法对改善2型糖尿病胰岛素抵抗有较好的疗效,体现了中医药治疗本病的综合作用和特色优势。

口服滋肾健脾化瘀片联合抗VEGF治疗对DR患者房水细胞因子影响的研究

目的探讨口服滋肾健脾化瘀片联合玻璃体腔注射康柏西普(IVC)治疗对糖尿病视网膜病变(DR)患者房水中细胞因子的影响。方法采用真实世界前瞻性研究。纳入2019年3月—12月在广州中医药大学第一附属医院眼科接受口服滋肾健脾化瘀片联合IVC治疗的DR患者32例(42只眼)作为观察组(DR组),在IVC术中抽取房水;纳入同期住院行白内障手术的患者27例(31只眼)作为对照组,在白内障手术中抽取房水。通过Luminex法检测2组患者房水中VEGF家族(VEGF-A、PLGF),PDGF家族(PDGF-AA、PDGF-BB),ANGPTL4,炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1、TNF-α)等11种细胞因子表达。8周后,DR组行IVC术时再次抽取房水,比较DR组治疗前后房水中细胞因子表达的差异。结果(1)与对照组比较:DR组治疗前VEGF-A、PLGF、PDGF-AA、ANGPTL4、IL-6、IL-8、MCP-1、ICAM-1、TNF-α水平均高于对照组(Z_(VEGF-A)=-4.553,Z_(PLGF)=-3.588,Z_(PDGF-AA)=-4.464,Z_(ANGPTL4)=-7.265,Z_(IL-6)=-4.488,Z_(IL-8)=-5.770,Z_(MCP-1)=-5.100,Z_(ICAM-1)=-3.625,均P=0.000;Z_(TNF-α)=1.995,P=0.046),而IL-1β水平低于对照组(Z=-3.167,P=0.002);(2)DR组治疗前后比较:治疗后,DR组房水中细胞因子VEGF-A水平低于治疗前(Z=-5.608,P=0.000),IL-8浓度高于治疗前(Z=-2.907,P=0.004),而其余细胞因子治疗前后比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论DR的发生、发展可能与细胞因子中的VEGF家族、PDGF家族、ANGPTL家族及炎症因子相关;口服滋肾健脾化瘀片联合抗VEGF治疗能够在一定程度上使DR患者房水中VEGF-A水平降低,为该病的中西医结合治疗提供了一定依据。

滋肾健脾化瘀片的质量标准研究

目的建立滋肾健脾化瘀片的质量控制方法。方法采用薄层色谱法鉴别滋肾健脾化瘀片的酒萸肉、三七、大黄;采用高效液相色谱法测定葛根素的含量。结果薄层色谱法斑点清晰、分离度好,且各阴性对照无干扰;葛根素在进样量为0.05~0.50μg范围内线性关系良好（r=0.999 9）,平均加样回收率为100.43%,RSD为1.39%（n=6）。结论该方法专属性强、灵敏度高、重复性好,可用于滋肾健脾化瘀片的质量控制方法。

健脾滋肾化瘀片对糖尿病大鼠胰岛功能的影响

目的探讨健脾滋肾化瘀片对糖尿病大鼠胰岛功能的影响。方法选择糖尿病大鼠60只,随机分为健脾滋肾化瘀片低(0.5 g/kg)、中(1.0 g/kg)、高(2.0 g/kg)剂量组及模型对照组、降糖灵组各12只,另选10只正常大鼠作为正常对照组。连续给药10周后,分别观察各组大鼠血糖、血脂和血清胰岛素水平及胰腺中胰岛细胞的变化。结果与正常对照组比较,模型对照组血糖、血脂和胰岛素均明显升高(P均<0.01),胰岛分布不均匀,部分区域有胰岛细胞萎缩或消失,另有部分区域胰岛细胞增生肥大。给予不同剂量健脾滋肾化瘀片后,大鼠胰岛素水平较模型对照组低(P<0.05),胰岛细胞大小分布较均匀。降糖灵组表现出同样的作用特点,作用强度与健脾滋肾化瘀片高剂量作用相当。结论健脾滋肾化瘀片具有降糖、降脂、促进胰岛素的利用和保护胰岛结构的功能,可用于治疗2型糖尿病。