HPLC法同时测定健腰密骨片浸膏粉中5种指标成分

目的:建立健腰密骨片浸膏粉的多成分定量分析方法,为评价浸膏粉中间体的质量提供依据。方法:采用HPLC法,以乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相,梯度洗脱,测定健腰密骨片浸膏粉中5种成分的含量。结果:木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ5种成分在各自质量浓度范围内呈良好线性关系,r≥0.9997;5种化合物的平均回收率分别为100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%。该方法的专属性、重复性均良好。结论:该分析方法准确、重复性好,可作为健腰密骨片浸膏粉的质量控制方法。

不同剂量健腰密骨片对骨形成和小鼠骨髓间充质干细胞中BMP-7表达的影响

目的探讨不同剂量健腰密骨片对小鼠椎体和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨分化过程中骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)表达的影响。方法选取1月龄昆明小鼠48只,雌雄各半,按体质量随机分为健腰密骨片高、中、低剂量组及生理盐水4组,灌胃8周后取材。用Micro-CT扫描分析L4腰椎,免疫组化染色观察不同剂量健腰密骨片对椎体BMP-7表达的影响;分离培养获得各组小鼠原代骨髓间充质干细胞(BMSCs),利用碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量RT-PCR法检测BMSCs成骨分化过程中BMP-7的表达情况。结果与生理盐水组比较,健腰密骨片高剂量组能够改善小鼠椎体三维结构,促进椎体BMP-7蛋白的表达;健腰密骨片高剂量组能够明显增加BMSCs中ALP活性,上调成骨基因BMP-7 mRNA的表达量(P<0.05)。结论健腰密骨片高剂量组能够明显提高小鼠椎体骨量,促进BMSCs成骨分化,上调椎体和BMSCs成骨分化过程中BMP-7表达,从而促进骨形成。

健腰密骨片中丹酚酸B的质量控制方法建立

目的:建立健腰密骨片中丹酚酸B的质量控制方法。方法:通过条件摸索,建立复方健腰密骨片中丹酚酸B薄层色谱定性鉴别方法和高效液相色谱定量检测方法。结果:制剂中丹酚酸B在薄层层析板上显示一清晰斑点、且重现性好、专属性强、阴性对照无干扰。HPLC测定显示丹酚酸B在0.191~15.291 mg范围内呈良好线性关系,回归方程为Y=1190.30X-253.63,r=0.9999;平均加样回收率及RSD分别为96.72%和1.46%。结论:新建的检测方法简便、快速、准确,重复性好,可作为健腰密骨片中丹酚酸B的质量控制方法,可以更好地保证制剂的整体质量,具有很强的实用性。

ELSD-HPLC法测定健腰密骨片中黄芪甲苷的含量

目的建立健腰密骨片中黄芪甲苷的ELSD-HPLC含量测定方法,为评价健腰密骨片质量提供依据。方法采用ELSD-HPLC法,用沃特世XBridge C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈和水作为流动相,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为25℃,测定健腰密骨片中黄芪甲苷含量。结果黄芪甲苷进样量在0.4966~7.946μg范围内,其对数与峰面积对数呈良好线性关系(r=0.9990);平均加样回收率以及RSD分别为101.86%和3.97%。结论该方法准确、简便,重复性好,为健腰密骨片质量评价提供可靠的分析方法。

微波消解-ICP-MS同时测定健腰密骨片中5种重金属及有害元素及其不确定度评定

目的建立微波消解-电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)同时测定健腰密骨片中铜(^(63)Cu)、砷(^(75)As)、镉(^(111)Cd)、汞(^(202)Hg)和铅(^(208)Pb)的含量,并科学评估含量结果不确定度。方法加入硝酸并按设定的程序进行微波消解处理,选取锗(^(72)Ge)、铟(^(115)In)、铋(^(209)Bi)元素作为内标物质,采用ICPMS法同时测定5种重金属及有害元素含量,并参考CNAS-GL006:2019《化学分析中的不确定度评估指南》进行不确定度评估。结果建立的5种重金属及有害元素测定方法线性关系良好,r均大于0.999,重复性RSD均小于8%,加样回收率结果在83.3%~103.4%范围内,计算扩展不确定度后,5种元素测定结果分别为^(63)Cu(0.621±1.89×10^(-2))mg/kg、^(75)As(0.108±1.09×10^(-2))mg/kg、^(111)Cd(0.004±4.68×10^(-4))mg/kg、^(202)Hg(0.045±1.89×10^(-3))mg/kg、^(208)Pb(0.014±8.88×10^(-4))mg/kg,均未超过标准限度。结论建立的方法准确、高效,灵敏度高,并为ICP-MS检测不确定度评估提供依据。

不同剂量健腰密骨片对骨形成和小鼠骨髓间充质干细胞BMP-7、OC表达的影响

目的:研究健腰密骨片对骨形成及骨髓间充质干细胞(BMSCs)骨形态发生蛋白(BMP-7)、骨钙素(OC)表达的影响。方法:选取1月龄昆明小鼠60只,雌雄各半,按体质量随机分为健腰密骨片高、中、低剂量组,仙灵骨葆组,生理盐水组,灌胃8周后取材。用Micro-CT扫描分析L4腰椎,免疫组化染色观察不同剂量健腰密骨片对椎体BMP-7、OC表达的影响;分离培养获得各组小鼠原代BMSCs,利用碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量RT-PCR法检测BMSCs成骨分化过程中BMP-7、OC的表达情况。结果:与生理盐水组比较,健腰密骨片高剂量组能够改善小鼠椎体三维结构,明显升高小鼠椎体骨密度(P<0.05),增加椎体骨小梁数目和骨小梁厚度增加(P<0.05),降低骨小梁分离度(P<0.05),促进椎体BMP-7、OC蛋白的表达;健腰密骨片高剂量组能够明显促进BMSCs中ALP的表达,上调成骨基因BMP-7、OC m RNA的表达量,其中OC m RNA升高显著(P<0.05)。结论:健腰密骨片高剂量组能够明显提高小鼠椎体骨密度,促进BMSCs成骨分化,上调椎体和BMSCs成骨分化过程中BMP-7、OC表达,从而促进骨形成。

健腰密骨片对成骨细胞增殖分化和BMP信号通路报导基因活性的影响

目的:探讨健腰密骨片对成骨细胞的影响及作用机制。方法:常规培养转染12×SBE-OC-Luc报导基因的成骨细胞株OCT-1细胞(以下简称12×SBE-OC-Luc-OCT1细胞),采用健腰密骨片含药血清进行干预48 h,并以骨形态发生蛋白(BMP)2纯化蛋白(50 ng/ml)为阳性对照。用MTT法检测成骨细胞增殖率,实时荧光定量RT-PCR法检测成骨细胞中Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen)、骨钙素(osteocalcin)和BMP2mRNA的表达以及荧光素酶活性检测法检测成骨细胞12×SBE-OC-Luc的活性。结果:与正常对照组比较,健腰密骨片能明显促进成骨细胞的增殖(P<0.05);显著增加成骨细胞中typeⅠcollagen、osteocalcin和BMP2的mRNA表达量(P<0.05);能明显促进成骨细胞中BMP报导基因12×SBE-OC-Luc的荧光素酶活性(P<0.05)。结论:健腰密骨片可通过促进BMP2、typeⅠcollagen和osteocalcin的表达及BMP信号通路报导基因12×SBE-OC-Luc的活性,从而促进成骨细胞的增殖与分化。

健腰密骨片延缓OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的研究

目的:观察健腰密骨片对OPG基因敲除小鼠椎间盘退变的影响。方法:30只12周龄小鼠随机分为WT,OPG^(-/-),健腰密骨片组,每组10只,健腰密骨片组采用含药饲料干预3个月,3月后取材获得各组颈椎,以颈5-6椎间盘为观察对象,甲苯胺蓝染色观察椎间盘形态,免疫组化染色观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原的表达变化,qPCR分析椎间盘组织中Aggrecan和Col10α1的表达。结果:甲苯胺蓝染色显示健腰密骨片组椎间盘软骨终板中部分缺损和钙化明显减少。免疫组化显示健腰密骨片促进OPG^(-/-)小鼠椎间盘Ⅱ型胶原的表达,降低Ⅹ、Ⅰ型胶原的表达,qPCR结果显示健腰密骨片上调OPG^(-/-)小鼠椎间盘Aggrecan mRNA的表达水平,下调Col10α1 mRNA水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健腰密骨片可能通过改善椎间盘软骨细胞代谢延缓OPG^(-/-)小鼠的椎间盘退变。