人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术，构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，采用脂质体法导入ＳＧＣ－７９０１细胞，检测细胞生长曲线、端粒酶活性凋亡、细胞周期、软琼脂中克隆形成率及裸鼠体内成瘤性的变化。结果 成功构建ｈＴＲＴ正、反义真核表达载体，并导入ＳＧＣ－７９０１胃癌细胞株中，获得稳定表达正、反义基因的细胞系７９０１－Ｓ、７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２。７９０１－ＡＳ１和７９０１－ＡＳ２出现显著生长抑制现象，端粒酶活性明显下降，细胞凋亡增加，异型性减小，Ｇ０／Ｇ１期细胞增加，Ｓ和Ｇ２Ｍ期细胞减少，增殖指数减小，软琼脂中无克隆形成，裸鼠体内成瘤消失。结论ｈＴＲＴ反义基因治疗可以明显抑制ＳＧＣ－７９０１细胞的增殖，部分逆转肿瘤细胞的恶性表型，其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的，提示ｈＴＲＴ基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。

榄香烯对HeLa细胞端粒酶催化亚单位基因表达的作用

目的 :探讨HeLa细胞凋亡过程中 ,人乳头瘤病毒 18型E6 (HPV18 E6 )基因、p5 3基因、端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因表达的变化 ,为临床诊断、治疗宫颈癌提供新思路。方法 :用流式细胞仪、电镜证实细胞凋亡 ;用PCR和RT PCR方法研究HPV18 E6基因、p5 3基因、hTERT基因表达在细胞凋亡过程中的变化及相互关系。结果 :在榄香烯作用下 ,HPV18 E6基因、p5 3基因表达没有变化 ,但hTERT基因表达受到抑制。结论 :榄香烯诱导HeLa细胞凋亡过程中 ,hTERT基因表达受到明显抑制 ,对于耐药性肿瘤 。

人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体,研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法:从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上,酶切获取约1100bp的启动子片段,克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中,构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒pEGFP-N1作为阳性对照,pEGFP-1作为阴性对照,脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D,NCI-H446,A2,A549,LTEP-a-2,YTMLC和人正常细胞MRC-5,荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果:双酶切和单酶切均显示载体pEGFP-hTERTp构建成功。细胞转染结果显示:在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达,而在MRC-5中无EGFP表达;转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论:hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。

端锚酶反义寡核苷酸联合反义端粒酶催化亚单位对人肺腺癌A549细胞端粒动力学的影响

背景与目的:端锚酶是真核生物体内的一种重要的功能蛋白,对调节细胞端粒长度及参与细胞衰老和永生化过程起着重要的作用。本研究探讨端锚酶及端粒酶反义寡核苷酸联合作用对人肺腺癌A549细胞端粒相关蛋白表达和翻译的影响,以及对端粒缩短效能和细胞周期的作用。方法:将培养的A549细胞分为空白对照组、端锚酶正义寡核苷酸对照组(tankyrase sense oligonucleotide,sTANKS)、端粒酶催化亚单位正义寡核苷酸对照组(human telomerase reverse transcriptase sense oligonucleotide,shTERT)、端锚酶反义寡核苷酸实验组(tankyrase antisense oligonucleotide,asTANKS)、端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸实验组(human telomerase reverse transcriptase antisense oligonucleotide,ashTERT)、端锚酶及端粒酶催化亚单位反义寡核苷酸联合实验组(asTANKS+ashTERT)。分别与不同的正、反义寡核苷酸作用,采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法观察端粒酶催化亚单位的mRNA表达,ELISA-PCR法测定端粒酶活性,Western blot法观察端锚酶活性,Q-FISH法检测各组端粒的平均长度;并通过传代实验观察不同正、反义寡核苷酸对A549细胞传代寿命的影响。结果:ashTERT能明显抑制端粒酶催化亚单位的mRNA表达及蛋白质活性,不影响端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.59±0.07)kb];细胞在经过56.92±0.46个倍增时间(population double,PD)连续培养终止。asTANKS不影响端粒酶催化亚单位mRNA表达及蛋白质活性,却能明显抑制端锚酶活性;作用48h后细胞平均端粒长度明显缩短[(7.33±0.09)kb];细胞在经过(53.33±0.57)PD连续培养终止。ashTERT+asTANKS联合作用同时抑制端粒酶和端锚酶,其细胞平均端粒长度缩短更为明显[(3.55±0.08)kb],流式直方图上FITC荧光"左偏"更显著,与ashTERT、asTANKS比较差异有显著性(t=37.33、32.50,P<0.001);ashTERT+asTANKS组细胞在经(24.53±0.40)PD后培养终止,与ashTERT、asTANKS比较差异也有显著性(t=53.38、43.39,P<0.001)。结论:端锚酶反义寡核苷酸对A549细胞端粒长度的抑制有别于端粒酶途径,它不仅能通过影响端锚酶活性,缩短A549细胞端粒的平均长度,而达到缩短肿瘤细胞生存寿命的目的;而且可与端粒酶抑制剂产生协同作用,明显缩短肿瘤细胞的生存周期,可能成为抗癌作用的新靶点。

端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位转染血管内皮细胞后,血管内皮细胞增生活性的变化。方法 应用胶原酶消化法培养脐静脉血管内皮细胞(UE),ABC法检测内皮细胞CD34表达。脂质体介导内皮细胞转染,MTT法测定细胞代谢活性并测定细胞生长曲线。基于逆转录聚合酶链反应的端粒重复末端扩增分析法检测端粒酶活性表达。结果 培养的细胞贴壁后为单层呈铺路石状排列。细胞爬片CD34染色呈阳性,pBABE-HYGRO-hERT转染内皮细胞测定端粒酶活性的吸光度为0.889。MTT实验表明:在各个时间点转染阳性细胞(HC)的吸光值都高于脐静脉血管内皮细胞(UE)(P<0.05)。UE与HC的细胞生长曲线形态相似,8 d内HC数量增长了约4倍。在各个时间点:HC较UE细胞数多(P<0.05)。结论 pBABE-HYGRO-hTERT转染内皮细胞后,提高了内皮细胞端粒酶的活性和增殖能力。

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。方法1用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。结论hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。

miRNA-375靶向磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨miRNA-375靶向磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α(PIK3CA)对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。方法选取宫颈癌细胞系Si Ha,分别转染mi RNA-375模拟基因、mi RNA-375抑制剂、对照模拟基因及对照抑制剂,采用RT-PCR法检测mi RNA-375表达,Western blot检测PIK3CA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证mi RNA-375与PIK3CA的靶向关系。结果转染miRNA-375模拟基因后miRNA-375表达上调,PIK3CA蛋白表达降低(P<0.05);转染miRNA-375抑制剂后miRNA-375表达降低,PIK3CA蛋白表达增强(P<0.05)。转染miRNA-375模拟基因后SiHa细胞增殖活性、迁移能力降低(P<0.05);转染miRNA-375抑制剂后SiHa细胞增殖活性、迁移能力增强(P <0.05)。miRNA靶基因预测软件检测结果显示,miRNA-375能作用于PIK3CA 3'-UTR。与转染对照模拟基因比较,共转染miRNA-375模拟基因与PIK3CA-WT可使SiHa荧光素酶活性降低(P <0.05)。结论 miRNA-375可抑制宫颈癌细胞增殖及迁移,其机制可能与靶向调控PIK3CA有关。

三氧化二砷对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位表达的影响

目的:研究三氧化二砷(As2 O3 )注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位人端粒逆转录酶(hTERT)表达的影响。方法:建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型,随机分为生理盐水组、As2 O3 低剂量(2 .5mg·kg-1)组、As2 O3 高剂量(5mg·kg-1)组及5 - FU(2 0mg·kg-1)组。腹腔注射As2 O3 ,利用银染 端粒重复扩增(TRAP)法测定人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性、RT PCR法检测hTERT的表达。结果:生理盐水组及5 -FU组端粒酶活性及其催化亚单位表达不受影响,不同剂量As2 O3 均明显抑制端粒酶活性及其催化亚单位表达。结论:As2 O3 注射液对人结肠癌裸鼠移植瘤端粒酶活性及其催化亚单位的表达有抑制作用。

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的探讨人端粒酶催化亚单位基因（human telomerase catalytic subunit，hTERT）Ex2-659A／G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系。方法对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者（病例组）和同期在上述医院查体的健康人群156例（对照组）进行病例对照研究；采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术（PCR—RFLP）对2组进行基因型分析，比较各基因型分布频率和发病风险的关系。结果病例组hTERT Ex2-659A／G位点AA、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异。病例组A、G等位基因频率分别为44．74％和55．26％，对照组为43．42％和56．58％，2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异（χ^2=5．3734，P=0．0204）。与G／G基因型相比，A／G和A／A2种基因型的个体患胃癌的危险度（OR）分别为0．519（95％CI：0．310—0．870，P=0．013）、0．550（95％CI：0．255～1．188，P=0．128）。结论hTERT Ex2-659A／G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

端粒酶催化亚单位基因转染对人胚胎成纤维细胞表型及寿命的影响

目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEFs)寿命的影响以及基因转染后细胞是否存在恶性表型。方法应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs,Westernblot检测hTERT蛋白及I、III型胶原表达。染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验以及形态学观察分析转染细胞是否存在恶性表型。结果外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT蛋白和I、III型胶原表达增加,体外传代次数增加,传至75代仍保持以2d的倍增周期生长,并且染色体仍为23对,均为正常二倍体细胞;裸鼠皮下不具有成瘤的能力;而hEFs和空载转染细胞传至60代左右平均五六天传代1次,出现生长停滞现象。结论外源性hTERT基因转染使胎儿成纤维细胞增殖旺盛,寿命延长,且不具有恶性表型。

人端粒酶催化亚单位及其相关蛋白在骨肿瘤中的表达

目的:研究骨肿瘤中端粒酶相关基因中,人端粒酶催化亚单位(humantelomerasecatalyticsubunit,hTERT)和人端粒酶相关蛋白(humantelomeraseassociatedprotein,TP1)两个重要成分的表达及对评估肿瘤良、恶性的意义。方法:提取50例手术切除骨肿瘤组织、2种人成骨肉瘤细胞系Saos-2、OS732和原代培养人成骨细胞的总RNA。用一步RT-PCR方法检测hTERT和TP1mRNA的表达。结果:所有骨肿瘤标本及细胞系均检测到TP1的表达。hTERT在17例良性骨肿瘤、33例骨肉瘤、2种人成骨肉瘤细胞系和人成骨细胞的表达率分别为64.7%、57.6%、0%和0%。良、恶性骨肿瘤间hTERT表达的差异不具有显著性(P>0.05),不同分化程度骨肉瘤间hTERT表达的差异也不具有显著性(P>0.05)。结论:一步RT-PCR是检测端粒酶亚单位的有效方法。hTERT和TP1表达水平的上调在骨肿瘤恶性进展中可能不起主要作用,在骨肿瘤发展和维持中可能有替代性(ALT)机制导致细胞永生化。

人端粒酶催化亚单位和c-myc蛋白在胃癌及癌前病变中的表达及意义

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)和c-myc蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达及意义。方法:应用免疫组织化学技术检测71例慢性胃炎和胃癌中hTERT和c-myc蛋白的表达,其中慢性胃炎伴萎缩者18例,伴肠化生者16例,伴中、重度不典型增生者16例,胃癌21例。结果:hTERT和c-myc蛋白的表达率在胃癌组织中均高于不典型增生、肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在不典型增生组织中均显著高于肠化生、萎缩性胃炎组织(P<0.05);在肠化生组织中均显著高于萎缩性胃炎组织(P<0.05)。hTERT蛋白表达率在c-myc蛋白阳性患者中显著高于c-myc蛋白阴性患者(P<0.01)。结论:hTERT与c-myc蛋白在胃癌发生发展过程中,均可能发挥重要作用,对胃癌的发生、发展起促进作用,c-myc表达增加可能是胃黏膜上皮细胞端粒酶激活的重要机制之一。

非小细胞肺癌端粒酶催化亚单位的表达及其与c-myc基因的相关性

目的 研究端粒酶催化亚单位 (hTERT)在非小细胞肺癌的表达及其与c -myc基因的相关性 ,并探讨肺癌hTERT激活的可能调节机制。方法 应用荧光半定量逆转录聚合酶链反应方法 (RT -PCR)检测非小细胞肺癌组织hTERT及c-mycmRNA表达水平 ,对两者进行统计学相关分析。结果 5 1例非小细胞肺癌hTERT表达阳性率为 86 .3% ,明显高于癌旁正常肺组织和良性病变组织 (分别为 14 .3%和 2 7.3% )。hTERT的表达和肿瘤组织病理类型、分化程度、临床分期、肿块大小及淋巴结转移指标间未见明显相关性。相关分析显示hTERT与c-mycmRNA表达存在显著相关性 ,相关系数r =0 .6 33(P <0 .0 0 1)。结论hTERT对肺癌诊断具有潜在临床价值 ,hTERT的表达与c -myc表达存在显著相关性 ,进一步支持c -myc的过度表达可能是肺癌端粒酶激活和调节的机制之一。

大肠癌组织中端粒酶催化亚单位的表达及临床意义

目的:探讨端粒酶催化亚单位(hTERT)在大肠癌患者中的表达情况及与及临床病理类型、淋巴结转移和复发之间的关系.方法:免疫组化法测定大肠癌组织(n=45)、腺瘤组织(n=16)及正常大肠黏膜(n=10)hTERT表达情况,并将hTERT表达情况与大肠癌临床病理类型、淋巴结转移和肿瘤复发之间的关系进行总结.结果:大肠癌患者癌组织中的hTERT阳性率为77.8%,显著高于腺瘤组(2/16)和正常大肠黏膜组(0/10),有显著性差异(P<0.05).hTERT表达强度与淋巴结转移呈高度相关性(r=5.2,P<0.05).大肠癌复发转移平均时间阳性组为34±5mo,阴性组为20±6mo,差异有显著性(P<0.05).结论:hTERT在大肠癌组织中有高表达,hTERT免疫组化检测结果可以作为大肠癌早期诊断和淋巴结转移的一个重要参考指标.

端粒酶催化亚单位在涎腺腺样囊性癌中表达的研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位 (即端粒酶逆转录酶 ,hTRT)在涎腺腺样囊性癌中表达及意义。方法选用 32例腺样囊性癌标本 ,管状型 9例 ,筛孔型 17例 ,实体型 6例 ,癌旁正常腺体作为对照组。采用原位杂交技术检测hTRT的表达 ,并观察hTRT分布与患者年龄、肿瘤大小和组织学分型间关系。结果 32例腺样囊性癌hTRT阳性表达率为 87.5 %。结论 hTRT在腺样囊性癌中高表达 ,其在不同的组织学分型等组别间无差异。

胃粘膜病变中人端粒酶催化亚单位、c-myc蛋白的表达及其相互关系

目的探讨胃粘膜病变中人端粒酶催化亚单位(humantelomerasecatalyticsubunit,hTERT)的表达状况及其与c-myc蛋白表达的关系。方法应用免疫组织化学技术检测45例慢性胃炎和19例胃癌中hTERT和c-myc蛋白的表达。结果hTERT蛋白的表达率在胃癌组织中显著高于不典型增生、肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在不典型增生组织中显著高于肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在肠化生组织中显著高于萎缩性胃炎组织(P<0.05)。c-myc蛋白的表达率在胃癌组织中显著高于不典型增生、肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在不典型增生组织中显著高于肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在肠化生组织中显著高于萎缩性胃炎组织(P<0.05)。hTERT蛋白表达率在c-myc蛋白阳性患者中显著高于c-myc蛋白阴性患者(P<0.01)。结论在胃癌和胃癌前病变阶段,端粒酶(telomerase)与c-myc均可能发挥重要作用,促进了胃癌的发生、发展;c-myc表达增加可能是胃粘膜上皮细胞端粒酶激活的主要机制之一。

人端粒酶催化亚单位(hTERT)反义分子探针的制备与理化性质初步研究

制备放射性核素99Tcm标记的针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA的反义分子探针,探讨其在体外的稳定性和相关理化性质。针对hTERT mRNA(GEN-BANK号为AF015950)的第2331~2348位核苷酸(含18个碱基),即5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′(hTERT SON),设计反义寡核苷酸序列(hTERT ASON)为5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′;对hTERTASON进行适当修饰。通过双功能螯合剂S-Acetyl NHS-MAG3进行放射性核素99Tcm标记。针对影响标记的主要因素(SnCl2用量、反应体积、反应时间等)进行条件摸索,建立最优化标记方案。纸层析法测定反义分子探针(99Tcm-hTERT ASON)的标记率和放射化学纯度,计算比活度。检测99Tcm-hTERT ASON的放射稳定性与序列稳定性,以及血清蛋白结合率。所有结果通过统计学软件SPSS12.0进行分析。室温下反应15~30 min后,99Tcm-hTERT ASON的标记率为76%±5%(n=5);在相同条件下,无双功能螯合剂作用,ASON的标记率仅为5.0%±1.6%(n=5);二者比较有显著差异(P<0.05)。99Tcm-hTERT ASON放射化学纯度达到96%以上,比活度为1 850 GBq/g。在不同条件下,99Tcm-hTERT ASON的放射化学纯度在24 h内均达到93%以上。PAGE凝胶电泳显示99Tcm-hTERT ASON在与人新鲜血清37℃孵育6 h内未发生任何降解。与人新鲜血清37℃孵育1、3和6 h后,99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白结合率分别为15.0%±1.6%、18.0%±1.9%和20.0%±2.4%。99Tcm-hTERT ASON具有较高标记率、放射化学纯度和比活度;其放射稳定性和序列稳定性均良好,与血清蛋白结合率较低,适合作为反义显像剂用于进一步研究。

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体.方法:用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向.结果:经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0+6.4 kb两条带.反义重组质粒为1.0+2.5+3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性.结论:成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.