抗Caspase-7锤头状核酶在原代肝细胞内的切割活性研究

目的研究抗Caspase-7锤头状核酶在原代肝细胞内对靶基因的切割活性。方法构建含抗Cas-pase-7锤头状核酶的真核表达质粒pRz333。将其转染原代肝细胞后,用TNF-α和放线菌素D上调细胞内Caspase-7 mRNA的表达。RT-PCR和免疫印迹法检测Caspase-7mRNA和蛋白酶原的表达。用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果与诱导组相比,核酶组肝细胞内Caspase-7 mRNA的表达降低了29.34%;Caspase-7蛋白酶原含量下降了32.12%;细胞凋亡率减低了11.75%。结论抗Caspase-7锤头状核酶在原代肝细胞内能够特异性切割靶基因,使目的基因的mRNA和蛋白质表达下调,并能够减少肝细胞凋亡。

牛肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

为克隆表达牛肠激酶(enterokinase)轻链(EKL)编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCmT载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明,克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的牛肠激酶轻链基因全序列。随后,将目的基因片段插入pET39b中,构建了融合型表达载体pET39b EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。所获得的pET39b EKL经过酶切鉴定和测序,证实其插入方向、读码框架正确,所表达重组蛋白经SDS PAGE分析,相对分子量为65kDa,表达量达28%,通过镍亲和层析纯化得到融合蛋白DsbA rEKL的单一条带。该粗酶经脱盐后在适宜的缓冲体系中21℃温育过夜,显示出较高的自催化切割活性,为进一步进行重组牛肠激酶活性的研究及应用奠定了基础。