耐氨固氮型催娩克氏菌的某些生理特性

耐氨固氮型催娩克氏菌（KlebsiellaoxytocaNG13／pMC73A）的生长特性与其野生型亲本菌株相似。在好气和微好气环境中均能生长，对生长所需的碳源、氮源和无机盐类要求不严格。最适pH值为6—9，其生长温度范围较宽，10℃开始生长，最适生长温度30－35℃，45℃才受到抑制。具有比野生型菌株强的固氮能力，在含有10mM硫酸铵的培养基中能正常固氮，乙炔还原活性可达636．5nmolC2H4／ml·h，而野生型菌株在相同培养基中无固氮能力。

耐氨固氮的催娩克氏菌的高密度培养研究

根据耐氨固氮型催娩克氏菌的特点,对其发酵工艺进行了研究。确定了以葡萄糖为碳源,合理搭配适量的氮源及无机盐作为高密度培养的基础培养基;在培养的中后期,添加葡萄糖补充碳源,流加氨水补充氮源,同时将pH值稳定在6.5～6.8之间,通过控制适当的通气量、搅拌速度以维持适当的溶氧水平。培养终止时,NG13/pMC73A的菌数达到600～700×108cfu/mL,与原有工艺相比,菌数提高十倍以上,而培养周期基本相同。

chiA基因在稻根联合固氮菌E26和NG13中的表达

将带有粘质沙雷氏菌几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfⅠ片段分别克隆到表达载体pKK2 2 3 3和质粒pMC71A上 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA。将这 2种质粒转化稻根联合固氮菌阴沟肠杆菌E2 6 (EnterobactercloacaeE2 6 )和催娩克氏菌NG1 3 (Klebsiellaoxy tocaNG1 3 ) ,chiA基因在这 2菌株中获得高效表达。对表达产物的细胞定位测定表明 ,几丁质酶不仅存在于细胞周间质和胞内 ,而且还分泌到培养物上清液中。在对数生长后期 ,胞外、胞间质和胞内的几丁质酶活性分布分别为 2 3 %～ 2 8%、45 %～ 5 1 %和 2 1 %～ 3 2 %。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明 ,表达的几丁质酶蛋白分子量为 5 8kD。在受体细胞内 ,质粒pMChiA的稳定性要比质粒pKChiA高。