HPLC-ESI-MS对糖尿病大鼠脑纹状体与海马区儿茶酚异喹啉类化合物的检测

为探索糖尿病型帕金森病的分子机理,利用HPLC-ESI-MS分析了链脲霉素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型与对照大鼠的纹状体、海马区的儿茶酚异喹啉类物质含量的差异。研究发现,糖尿病大鼠纹状体、海马区的1-乙酰基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(ADTIQ),1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Salsolinol,Sal),N-甲基猪毛菜醇(NMSal)的含量升高,其中ADTIQ,Sal的含量升高明显,差异显著。结果提示,糖尿病型帕金森病的病因可能是由于血糖升高,导致脑内醛类物质含量增加,加剧了儿茶酚异喹啉类物质的累积,从而导致线粒体功能缺陷,引起神经元死亡,最终导致帕金森病症状。

细胞中多巴胺及儿茶酚胺异喹啉类物质的HPLC-MS/MS检测

建立了高效液相色谱-质谱法测定细胞样品中多巴胺(DA)、1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(Sal)和N-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(NMSal)含量的检测方法。细胞样品经超声破碎、离心取上清、1mol/L高氯酸溶液除蛋白并再次离心取上清后,用高效液相色谱-质谱测定,选择母子离子对多离子反应监测(MRM),内标法定量。采用DiscoveryHS F5柱(150mm×2.1mm,3μm);流动相为5mmol/L甲酸铵缓冲溶液(pH=3.0)-甲醇(80∶20,体积比)。DA、Sal和NMSal在0.5～100μg/L范围内线性关系良好(r>0.9995),检出限分别为0.20、0.34、0.33μg/L,日内和日间精密度(以相对标准偏差表示,RSD)均低于8%,回收率分别为91.4%～109.6%、87.4%～109.7%、88.0%～102.7%。用该方法检测经H2O2诱导的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,发现DA和Sal的含量与对照组相比都有显著增加。方法选择性好,灵敏度高,适用于测定细胞样品中DA、Sal和NMSal的含量的相关研究。

帕金森模型大鼠脑内儿茶酚胺异喹啉类化合物的形成与代谢

帕金森(PD)是一种常见的神经退行性疾病,确切的致病机理尚不清楚,其中环境因素引起的神经毒素假说受到广泛关注。本文提出了关于内源性神经毒素恶性循环导致PD的假说。为了验证该假说,建立了定位注射6-OHDA单侧损毁黑质-纹状体的PD Wistar大鼠模型,并采用HPLC-ESI-TOF分别检测了PD模型大鼠和对照组大鼠脑健侧和受损侧的黑质、纹状体中Sal和NMSal的含量。结果表明,PD模型大鼠受损侧黑质-纹状体中Sal和NMSal的含量都比健侧及其他对照组高,说明PD模型受损侧内源性儿茶酚胺异喹啉类神经毒素导致的恶性循环严重,对假说的验证提供了依据。

S-腺苷甲硫氨酸增加salsolinol对多巴胺能神经细胞SH-SY5Y的毒性

目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经退行性疾病,儿茶酚异喹啉类神经毒素(salsolinol,Sal)作为内源性神经毒素是其可能的致病因素,而S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)目前在帕金森病的治疗上有应用的可能,所以有必要对其在体内的作用进行研究。方法本实验采用体外培养的多巴胺能细胞SH-SY5Y,首先使用MTT的方法对Sal以及SAM与Sal共同诱导后细胞存活率进行研究,使用了Hoechst 33258染色的方式检测凋亡,并检测ATP,最后使用高效液相色谱偶联电化学检测器(high performance liquid chromatography couple electrochemical detector,HPLC-ECD)检测了Sal和SAM代谢生成的氮甲基去甲猪毛菜碱(N-methylsalsolinol,NMSal)在细胞中的浓度。结果 SAM可以促进Sal引起的细胞存活率的降低,同时凋亡水平升高,ATP浓度降低,而且SAM诱导之后,Sal代谢生成的NMSal浓度也随之升高。结论这些结果说明了SAM会促进Sal在多巴胺能神经细胞中的毒性作用,因此SAM可能不利于PD的治疗。

α-Synuclein蛋白过表达对小鼠纹状体的影响

帕金森病是世界第二大老年神经退行性疾病,致病机理极为复杂。α-synuclein(α-syn)是帕金森病主要病理特征的路易小体的主要组成成分,其突变基因α-syn A30P也与部分家族性帕金森相关。通过对过表达野生型人源α-syn WT及其突变体α-syn A30P蛋白的转基因小鼠的行为学检验、脑部纹状体中氧化应激水平以及儿茶酚胺异喹啉物质水平的检测,研究过表达α-syn蛋白对小鼠纹状体产生的影响。结果显示转基因小鼠模型与正常鼠相比,其协调能力明显下降,纹状体与全脑的比例显著降低。同时,模型鼠脑中的氧化应激水平与儿茶酚胺异喹啉物质的表达水平均显著升高。研究结果说明,α-syn蛋白及其突变体的过表达会引起小鼠脑部纹状体中氧化应激水平与儿茶酚异喹啉物质表达水平的升高,从而导致纹状体组织严重损伤。