辣椒miR169家族在非生物胁迫下的表达及启动子顺式作用元件分析

miRNA169(miR169)是植物中保守且规模较大的一类miRNA基因家族,其在非生物胁迫下的功能被广泛报道。为深入研究辣椒miR169基因家族(Can-miR169)在非生物胁迫下的表达及上游转录调控机制,以‘遵辣一号’(Zunla-1)为研究对象,利用生物信息学手段分析辣椒与其他植物miR169成熟体和前体保守性和进化关系。采用real-time PCR技术对干旱、低温、高盐、高温胁迫下辣椒miR169基因家族前体进行应答检测。克隆辣椒Can-miR169基因家族12个成员启动子,进行顺式作用元件预测及元件功能验证。结果显示:(1)miR169成熟体在植物中保守性强。(2)4种非生物胁迫下,辣椒miR169家族成员前体表达量相对于对照组差异显著。(3)成功克隆了Can-miR169基因家族12个启动子,顺式作用元件预测其家族启动子中含有大量与非生物胁迫相关的元件,如MYB、MYC、MBS、ABRE、LTR、DRE等。(4)经验证明,这些元件为干旱、低温、高盐等胁迫应答元件。本研究结果为进一步挖掘非生物胁迫下调控Can-miR169的转录因子,明确其上游调控机制提供新信息,为辣椒分子育种及品种改良提供新视野。

烟草BTB/POZ蛋白家族的鉴定及其在抗马铃薯Y病毒中的作用

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)侵染烟草(Nicotiana tabacum)会引起烟草脉带病,造成烟叶品质下降。broad complex,tramtrack,and bric-à-brac/pox virus and zinc finger(BTB/POZ)是动植物体内广泛存在的蛋白质家族,在植物生长和发育的各个环节都起着非常重要的作用。本研究鉴定到90个烟草BTB/POZ家族蛋白,对应71个基因。在这些蛋白质的序列中,识别到9种保守基序(motif),并根据其出现顺序将BTB/POZ家族成员划分至6个亚家族。结构域分析表明,BTB/POZ同一亚家族成员的结构域具有一致性。对BTB/POZ蛋白的三维构象进行预测发现,所有亚家族成员结构都以α螺旋为主,同一亚家族成员的三维构象相似。烟草品种K326和突变体M867(抗PVY)的BTB/POZ家族基因表达模式分析显示,叶片接种PVY后,NtBTB2M、NtBTB2K、NtBTB2L、NtBTB6E基因的表达丰度显著增加,这可能与烟草M867对PVY的抗性较强有关。顺式作用元件分析显示,NtBTB2K、NtBTB2L、NtBTB2M和NtBTB6E基因的上游2000 bp区域内含有若干逆境响应相关元件,包括水杨酸响应元件、MYB结合位点等,可能和这些基因的上调表达有关。本研究为BTB/POZ蛋白的功能研究提供了理论依据,为烟草抗病育种提供了一定参考。

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论

CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间存在的顺式作用元件

探讨趋化素样因子超家族成员 1,2基因 (CKLFSF1基因与CKLFSF2基因 )间的短序列对其下游基因表达的调控作用 .运用PCR技术扩增CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间的序列 ,将此片段插入含有萤光素酶 (luciferase)报告基因载体上 .以磷酸钙介导基因转染技术 ,将重组质粒以及阴性和阳性对照组质粒转染到HeLa细胞 ,进行瞬时表达分析 .在pGL3 Basic质粒中的报告基因萤光素酶无表达 ,但将CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列插入到启动子上游或下游后 ,显著抑制其下游基因的表达 ,萤光素酶活性明显降低 .结果提示 ,CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列不具有启动子活性 。

抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究

为确定拟南芥抗逆相关基因AtRPK1启动子的顺式功能元件,对其启动子区进行了分段克隆。通过5'端缺失方法得到203、316、604、809 bp 4个启动子片段,分别构建成p1300-pro-GUS表达载体,并转入拟南芥,进行GUS染色和GUS定量检测。通过对809 bp全长启动子转基因拟南芥GUS染色发现,转基因拟南芥的叶片、茎、花、根中均有表达,在分生能力强的组织和维管束集中的组织,AtRPK1基因启动子具有较高启动表达能力。5'端缺失启动子检测结果表明,转录起始点到启动子上游-114位点区域包含AtRPK1基因启动子的关键顺式作用元件。对启动子缺失片段转基因植株利用200 mmol·L-1NaCl胁迫3 h后,β-葡萄糖苷酸酶活力定量检测结果表明,在启动子上游-19位点处的GT-1顺式作用元件GAAAAA可能直接与盐胁迫应答相关。

DRE顺式作用元件dsDNA芯片制备

DRE顺式作用元件能与DREB转录因子特异结合,在诱导逆境(干旱、高盐、低温)基因表达过程中起重要作用。dsDNA(double strand DNA)微阵列芯片技术能够有效地检测序列特异性DNA结合蛋白质(转录因子)与大量DNA靶点(顺式作用元件)的特异性结合,可有效分析生物分子结合作用。根据DRE顺式作用元件核心序列设计并化学合成含发夹结构的单链DNA探针,采用TaqDNA聚合酶在片延伸,并对其在片延伸体系的反应温度、Mg2+浓度以及单链探针是否变性等条件进行了优化。结果表明,50℃的反应温度,2.5mmol/L的Mg2+浓度和单链不变性是TaqDNA聚合酶在片延伸的最佳条件。优化方法制备的dsDNA芯片将更有利于DRE顺式作用元件与DREB抗逆转录因子相互作用的研究。

人NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR的定点突变分析

目的对NFBD1启动子区域顺式作用元件CHR进行定点突变分析,以分析CHR在NFBD1转录调控中的作用。方法以原有NFBD1核心启动子荧光素酶报告基因重组体NFBD1-PS1-325为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术对NFBD1启动子区域中的CHR位点进行定点突变,构建相应的CHR定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性,分析CHR定点突变对NFBD1启动子活性的影响;结合阿霉素处理,分析CHR在DNA损伤后NFBD1转录下调中的潜在作用。结果CHR定点突变后能显著降低NFBD1的启动子活性;CHR定点突变后显著减弱了DNA损伤后NFBD1的转录下调比例。结论CHR参与NFBD1的基础转录调控及DNA损伤后的转录下调。

家蚕丝素P25蛋白基因启动子顺式作用元件的功能分析

为了阐明蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统及实时荧光定量PCR等技术,对家蚕Bombyx mori丝素P25基因启动子上游1233bp的活性及其调控元件的功能进行了分析。结果表明:在P25启动子上游-423～-1233区和-127～-238区存在正调控元件,在-238～-423区段存在负调控元件;PSGF和BMFA两结合元件在P25基因表达中起负调控作用。PSGF结合元件对A3启动子在后部丝腺的活性具有一定的增强作用,进一步验证了PSGF调控元件的功能。通过对P25基因启动子的活性分析,尤其是对PSGF和BMFA调控元件的功能分析,有利于进一步了解P25基因表达调控的精细机制。

拟南芥AtHAK5基因启动子顺式作用元件功能域的鉴定

为鉴定AtHAK5启动子中的功能域,并进一步确定对应的转录因子。将AtHAK5编码拟南芥高亲和性钾转运体6个不同长度的启动子片段克隆到双元表达载体pORE R1中β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的上游,构成promoter AtHAK5∶∶GUS融合基因。通过农杆菌侵染野生型拟南芥花序,得到稳定表达该融合基因的T3转基因种子。通过基于GUS活性的组织化学染色法,对这些来自T3转基因种子、经过低钾处理的幼苗进行分析,确定AtHAK5启动子中感应低钾环境的顺式作用元件位于起始转录上游-471～-267范围内。

杜仲MEP途径系列基因5′端非编码区的顺式作用元件预测

为深入了解杜仲MEP途径基因5′端非编码区的功能,在杜仲转录组和全基因组序列的基础上,利用生物信息学方法系统预测了MEP途径系列基因5′端非编码区顺式作用元件的结构和功能。生物信息学分析表明:EuDXS2基因5′端非编码区预测出共有22种共220个顺式作用元件,其中包含启动子顺式元件145个TATA-box和39个CAAT-box的可能位点;EuDXR基因5′端非编码区预测出21种共127个顺式作用元件,68个TATAbox和32个CAAT-box;EuCMK基因5′端非编码区预测出24种共134个顺式作用元件,包含32个CAAT-box和68个TATA-box;EuMDS基因5′端非编码区共预测出30种共104个顺式作用元件,其中43个CAAT-box和23个TATA-box;EuHDS基因5′端非编码区预测出35种共126个顺式作用元件,包括29个CAAT-box和34个TATA-box;EuHDR基因5′端非编码区预测出24种共115个顺式作用元件,包含19个CAAT-box和67个TATA-box。

雷蒙德氏棉和拟南芥基因启动子中顺式作用元件的分布

随着雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组草图的完成,相关的基因组学研究已经全面展开。文章利用已公布的雷蒙德氏棉和拟南芥基因组序列,结合顺式作用元件(cis-regulatory element,CRE)数据库PLACE中的CRE序列信息,对两个物种中带有5′UTR注释的基因启动子上游1 000 bp序列进行CRE扫描和统计。结果表明,雷蒙德氏棉和拟南芥基因组中分别有44(12.3%)和57(15.5%)个CRE在启动子的特定位置呈峰状分布,其中在两个基因组均呈峰状分布的有34个,这些CRE又可以根据核心序列分为4大类。TATABOX类CRE顶峰在启动子中出现的位置和其真实位置(~30 bp)具有一致性,预示CRE真实位置在不同基因启动子中相对保守,从而推测本研究中呈峰状分布CRE的顶峰位置可能就是转录因子和该CRE结合的真实位置。而同一CRE在两个基因组中存在的位置差异则主要源于雷蒙德氏棉基因的5′UTR长度变异大于拟南芥。另外,文章还发现绝大多数峰状分布的CRE的位置都集中在110 bp^0 bp之间,这种集中的分布可能更有利于转录因子之间相互作用,从而调控下游基因的表达。

多个顺式作用元件调节血管紧张素原基因表达

血管紧张素原是最强的血管活性物质——血管紧张素Ⅱ的唯一前体，在不同的生理和病理条件下，其水平各异．为了研究血管紧张素原基因表达的调控，将人血管紧张素原基因５′端侧翼序列１．２ｋｂ同氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）基因编码序列连接，构成表达载体，并且在此基础上构建５′端系列缺失的突变表达载体，用这些表达载体转染ＨｅｐＧ２和ＣＯＳ－７，确定了正负调控元件；同时应用ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动检测技术，发现核蛋白质与该顺式元件的结合，从而证明多个顺式作用元件调节血管紧张素原基因的表达．

胰岛素基因及其顺式作用元件和反式作用因子

胰岛素基因及其顺式作用元件和反式作用因子杨绍华，陈俊杰（华西医科大学生化与重组ＤＮＡ室，成都６１００４１）关键词胰岛素基因，顺式作用元件，反式作用因子胰岛素基因迄今虽已从多种脊椎动物分离克隆、但对它的研究主要是以鼠和人的基因为对象进行的。除三种鼠（大...

真核基因特有的顺式作用元件──MAR

真核基因特有的顺式作用元件──ＭＡＲ周丛照（中国科技大学生物系，合肥２３００２７）关键词顺式作用元件，ＭＡＲ在真核生物的细胞核中，存在一种主要由非组蛋白的纤维蛋白和大分子量的ＲＮＡ所组成的三维网架体系，这就是所谓的核基质（ｎｕｃｌｅａｒｍａｔｒｉｘ）...

利用基因组数据分析水稻基因顺式作用元件

为了研究籼粳亚种基因调控序列的总体特性,我们利用籼粳稻以及拟南芥基因组和全长mRNA序列获取了大量高可信度的调控序列,通过这些序列,分析了水稻基因调控序列顺式作用元件(信号)的数量、分布以及与GC含量的关系等．研究结果表明:一些信号在水稻基因调控序列中发生显著的数量变化,同时一些信号数量在水稻与拟南芥基因间存在明显差异, 这说明这两种单双子叶植物间信号的使用上存在偏好,同时水稻不同类型基因以及特有与非特有基因间在信号的使用上也存在差异．这些差异信号的分布直接导致了调控序列GC含量的波动．本研究没有发现水稻籼粳两个亚种间在调控序列方面(顺式调节因子和GC含量等)存在明显差异．

NGAL基因不同长度片段的克隆及其顺式作用元件定位分析

NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)是lipocalin家族的一个新成员,可能是人类的一种新癌基因,但其在肿瘤中的表达调控机制尚不清楚。应用生物信息学手段对NGAL(X99133,包括外显子和内含子)进行分析发现,此区域内含有许多潜在的顺式作用元件,其中主要为增强子元件。对此设计了以下实验:应用PCR技术从食管癌细胞SHEEC基因组DNA中扩增不同长度的NGAL基因片段,将其连接到PGEMT-eacy载体中进行扩增,并测序。NCBI/BLAST分析确认扩增片段为NGAL基因所有,与实验所设计相吻合。在此基础上并应用KEGG/MOTIF检索分析系统对NGAL基因的上述区段进行了顺式作用元件定位分析,结果共鉴定出5个Score值=100分的顺式作用元件位点。这为NGAL基因增强子的鉴定提供了新线索。

GC盒不是人胰岛素基因启动子中关键顺式作用元件

目的鉴定人胰岛素基因启动子中的GC盒(-348￣-338)是否是启动子中的关键顺式作用元件。方法用PCR克隆人胰岛素基因启动子,构建由人胰岛素基因启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒,并对报告质粒中人胰岛素基因启动子中的GC盒进行删除和突变。将报告质粒转染到!细胞系"TC3中,测定细胞培养液上清中SEAP的活性强度,进而判定GC盒与人胰岛素基因启动子转录活性的关系。结果删除和突变人胰岛素启动子中的GC盒不能显著改变胰岛素基因启动子在#细胞中的转录活性。结论人胰岛素基因启动子中GC盒不是一个关键顺式作用元件。

脊椎动物肌动蛋白顺式作用元件分布的进化

具有组织和发育表达特异性的基因，很可能具有独特的顺式作用元件的分布模式，这种模式在很大程度上决定表达的特异性。脊椎动物肌动蛋白各亚型的表达具有严格的组织特异性。为改进和完善１种顺式元件匹配预测方法，在实验资料的基础上，统计出５种顺式元件的核苷酸分布权重矩阵模式，对脊椎动物肌动蛋白基因的５’调控区进行顺式元件的匹配预测和序列分析，获得了相应亚型的特异性的顺式元件编码分布模式，并分析了其进化趋势。

植物诱导型启动子及相关顺式作用元件研究进展

启动子是基因表达调控的重要元件,而启动子能正确调控基因的表达需要核心启动子以及上下游的顺式作用元件协同作用。诱导型启动子的应用减少了外源基因表达时产生的大量异源蛋白等代谢产物的积累和植物能量的浪费。综合近几年关于诱导型启动子的研究,从其启动子的结构及功能、分类、应用及相关顺式作用元件等方面进行概述,提出了在研究过程中存在的问题及展望。

水稻稻瘟病抗病基因Pi63顺式作用元件的载体构建

水稻稻瘟病抗性基因Pi63具有良好的田间抗性,且抗性与其表达量成正相关,但Pi63表达的调控机制尚未得到研究。为了研究Pi63的抗性机理,通过对Pi63启动子区域顺式作用元件的生物信息学分析,分段构建了4个含有不同顺式作用元件的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体pCAMBIA1391Z中。菌落PCR以及质粒DNA酶切鉴定后,经测序进一步确认。结果表明:以上4个缺失体载体构建成功。本研究为进一步研究启动子中不同顺式作用元件对于Pi63基因稻瘟病抗性的影响以及Pi63基因的表达特性奠定了基础。