蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1000μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景视网膜色素上皮（RPE）细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具，光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应，但是内质网应激（ERS）反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道。目的探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制。方法体外培养人RPE细胞株（ARPE-19），将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24h组，各光照组在培养箱内以（2000±500）lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型，正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射，筛选实验最适光照时间。将细胞分为正常对照组、光照组（光照12h）和苯基丁酸（4-PBA）预处理＋光照组，4-PBA预处理＋光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30min，然后光照细胞12h。采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧（ROS）的荧光强度；采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）质量浓度；分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6（ATF-6）、C／增强结合蛋白同源蛋白（CHOP）和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）mRNA及其蛋白的表达。结果光照后细胞形态呈长梭形改变，边界不清，细胞质脱颗粒，细胞碎片增多，且随光照时间的延长而加重。流式细胞仪检测发现，随光照时间的延长，人RPE细胞内ROS含量逐渐增加，细胞凋亡率逐渐升高，差异均有统计学意义（F=763．00、119．30，均P〈0．01）。ELISA法检测发现，与正常对照组比较，光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高，12h达峰。实时荧光定量PCR和Westernblot检测显示，与正常对照组比较，光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase．12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高，均于光照后12h达峰或升高，故选择光照12h为最适光照时间作为后续研究。4-PBA预处理＋光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=281．69、473．88、308．45，均P〈0．01）；ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=47．86、57．93、106．59，均P〈0．01）；细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组，差异均有统计学意义（F=88．64、245．47、101．ol，均P〈0．01）。结论（2000±500）lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加，并激活细胞的ERS反应，导致RPE细胞凋亡及炎症反应。ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应，进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程。

治疗性650 nm低功率半导体激光照射鸡视网膜的安全剂量研究

目的:观察650 nm半导体激光(功率2 mW)照射以视锥细胞为主的鸡视网膜后是否存在慢性光损伤,探讨该波段激光对视网膜的安全性。方法:采用随机数字表法将60只自然光线下饲养1个月的小鸡分为正常对照组、照射3-min组、照射6-min组和照射30-min组,每组15只。采用650 nm激光并按照分组不同各组小鸡双眼每日接受不同时间的激光照射。分别于激光照射后1个月(2月龄鸡)、3个月(4月龄鸡)和6个月(7月龄鸡)各组任选5只进行活体光相干断层扫描(OCT)检查,测定鸡的相对视网膜面积;采用过量麻醉法处死并制备视网膜切片,行苏木精-伊红染色和TUNEL染色,分别观察各组鸡视网膜面积变化和视细胞凋亡情况;实验眼制备视网膜匀浆,分别采用TBA法和NBT法检测鸡视网膜中丙二醛质量摩尔浓度和超氧化物歧化酶(SOD)比活性;采用Western blot法检测鸡视网膜中L/M视蛋白和视紫红质蛋白的表达。结果:2月龄时鸡照射30-min组视网膜中丙二醛质量摩尔浓度高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),4月龄时激光照射6-min组和照射30-min组丙二醛质量摩尔浓度均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P=0.026、0.003),7月龄时所有激光照射组鸡视网膜中丙二醛质量摩尔浓度均高于正常对照组,差异均有统计学意义(P=0.038、0.032、<0.01)。7月龄时激光照射30-min组鸡视网膜中SOD比活性和视紫红质蛋白相对表达量均低于正常对照组[SOD:(140.20±5.99)(nmol/s·mg)与(160.57±3.13)(nmol/s·mg);视紫红质蛋白:0.392±0.065与0.566±0.072],差异均有统计学意义(均P<0.05)。OCT检查显示,照射3-min组、照射6-min组和照射30-min组6个月内鸡视网膜相对面积及形态与正常对照组相比无明显差别;组织病理学检查显示各照射组鸡视网膜厚度均接近正常对照组,TUNEL染色显示各组鸡视网膜细胞排列整齐,未发现TUNEL阳性染色细胞。结论:实验鸡眼接受650 nm半导体激光照射时,用2 mW的功率每日照射6 min持续6个月不引起明显光损伤;每日照射30 min持续6个月引起视网膜中自由基含量增高和视紫红质减少,提示存在光损伤。