基于双光子激发荧光和二次谐波原理的显微成像技术在皮肤科中的应用

基于双光子激发荧光和二次谐波原理的双光子荧光显微镜(Two-photon fluorescence microscopy,TPM)是近年来生物成像领域最重要的发明之一。这项技术具有许多独特的优点,如激光穿透深度增强、光漂白毒性小和组织光损伤减少等。由于其优异的穿透能力和光学切片能力,TPM是目前在完整组织或活体动物体内以亚细胞分辨率对细胞和器官结构和功能活性进行实时、无创、在体监测强有力的工具,已被广泛应用于生物学和医学等各种领域。在过去的几年里,TPM作为临床研究和皮肤疾病实时检测、诊断和治疗监测的新方法,取得了较多的进展。将这些技术应用到临床研究和实践中需要临床医生了解它们的基本原理、优点和局限性等,本文简要的综述了双光子荧光激发原理、二次谐波原理以及TPM在皮肤病学领域中的应用。

活体细胞内双光子激发的光漂白特性

长波长光的强穿透能力和对活体细胞和生物组织光毒性很小的特性 ,使得双光子激发荧光显微术已经成为无损伤成像的重要工具 .可是双光子激发的高光子密度可能会产生高次光子相互作用 ,从而产生更快的光漂白 .从实验上研究了离体和活体细胞内的若丹明 12 3和若丹明B分别在单光子激发和双光子激发时的光漂白特性 .在体的实验结果与离体的实验结果一致 .正如期望的一样 ,单光子激发时光漂白速率非常近似地随着激发功率的增加而线性增加 .可是 ,双光子激发时的光漂白速率并不是正比于激发功率的平方 ,而是正比于激发功率的高次方 (>3 5 ) .对绿色荧光蛋白 (GFP)变异体CFP和YFP的实验也得到同样的结果 ,这就表明高次光漂白可能是双 (多 )光子激发中的普遍现象 .因此多光子的应用可能会受到强光漂白的限制 .

多光子激发荧光与毛细管电泳联用的实验研究

将多光子激发荧光探测与毛细管电泳技术相结合,研制了多光子激发荧光 毛细管电泳联用装置。这种方法可以高效快速的分离检测复杂样品中多种不同的荧光分子。作者对5HT ,FAD ,NADH这三种重要的生物分子,不用染料标记,分别用双光子激发和三光子激发,进行了直接的分离、识别和检测。得到的检测限分别是5HT 1. 0×10 -6mol·L-1,FAD 7. 4×10 -7mol·L-1,NADH 9. 8×10 -7mol·L-1。5HT的检测限比紫外吸收低2个数量级;FAD和NADH的检测限比紫外吸收低1个数量级。

毛细管电泳--多光子激发荧光检测分析生物胺

构建了毛细管电泳-连续光多光子激发荧光检测系统并应用于生物分析.对几种常见生物胺,如腐胺,尸胺,组胺,精胺,亚精胺和苯乙胺的分析结果表明,该系统具有分离效率高、质量检测灵敏度高和低消耗等特点,适于复杂体系如生物样品的测量.定量分析显示,生物胺的检测限在nM级,线性范围超过2个数量级,进一步将多光子激发荧光检测与传统单光子激发荧光检测结果对比,发现前者还具有改善分离选择性的优势.

绿荧光蛋白的双光子激发的荧光特性研究

利用双光子激发方式研究了重组绿荧光蛋白 (recombinantgreenfluorescentprotein,简称rGFP)的光转换特性 ,研究结果表明rGFP具有较强的双光子激发荧光。双光子激发的荧光偏振光谱表明rGFP在辐照前质子态和去质子态之间存在着有效的能量转移过程。rGFP辐照后导致生色团构象的变化 ,部分阻断了rGFP内源的氨基酸与生色团之间的能量转移过程 ,导致rGFP的双光子激发的荧光强度下降。观察到rGFP的三光子激发的荧光特性 ,这种三光子激发的荧光主要来源于rGFP内源的氨基酸 (色氨酸 ,酪氨酸等 )的吸收。研究结果对在实际使用定量的荧光显微镜时具有一定的指导意义。

活细胞内5-羟色胺可见荧光的多光子激发成像

应用多光子激发激光扫描显微镜对 5 羟色胺 (5 hydroxytryptamine ,5 HT)孵育的大鼠粘膜型肥大细胞进行自发荧光成像 ,首次观察到了活细胞内 5 HT相关的可见荧光 ,并对其产生机理进行了初步探讨 .实现了对活细胞内 5 HT空间分布的高分辨成像 ,为研究活组织或细胞内 5

铯原子nP_(3/2)(n=70—94)里德伯态的紫外单光子激发及量子亏损测量

基于成熟的光纤激光器、光纤放大器及高效激光频率转换技术,我们在实验中研制了一套瓦级输出的窄线宽连续波单频可调谐318.6 nm紫外激光系统,并在室温铯原子气室中实现了6S_(1/2)—nP_(3/2)(n=70—94)单光子跃迁里德伯激发.借助由铯原子6S_(1/2)(F=4)基态、6P_(3/2)(F′=5)激发态和nP_(3/2)(n=70—94)里德伯态构成的V型三能级系统,通过频率锁定于铯原子6S_(1/2)(F=4)—6P_(3/2)(F′=5)超精细跃迁的852.3 nm探测光束的吸收减弱信号获得了里德伯态的信息,并利用高精度波长计测量了铯原子nP_(3/2)(n=70—94)里德伯态的量子亏损值.经过与理论计算值的变化趋势进行对比,我们认为由于原子气室的里德伯屏蔽效应并不能完全屏蔽外部直流电场,铯原子气室内存在残余的直流电场,影响了对里德伯态的量子亏损值的实验测量.利用残余直流电场的Stark效应理论模型及其与有效主量子数n*的依赖关系,对铯原子里德伯态的量子亏损实验测量值进行了修正.修正后的铯原子nP_(3/2)(n=70—94)态量子亏损测量值为3.5591±0.0007,与理论计算值相吻合.

基于二次谐波和双光子激发荧光相结合的非线性光学成像技术在医学中的应用

1961年，Franken等使用红宝石激光器发出波长为694nm的激光穿过石英晶体，产生波长为347nm的紫外光，这是最早观察到的光学二次谐波（secondharmonicgeneration，SHG）现象，标志着非线性光学的诞生。1986年，Freund等怛首次将SHG用于老鼠尾腱的胶原纤维成像，

用李代数方法研究强激光场中双原子分子的多光子激发

组成系统哈密顿量的一组算子对易关系封闭 ,构成一个李代数。这组算子的统计平均值随时间的演化满足一个封闭的一阶线性微分方程组。讨论了有关物理量的统计平均值随时间的变化关系。

基于双光子激发荧光和二次谐波产生的非线性光谱分辨成像技术用于皮肤瘢痕的研究

病理性瘢痕不但可以导致患者畸形,影响美观,还可引起功能障碍,奇痒,甚至发生癌变。目前对瘢痕的形成机制尚不完全清楚,使得它的预防和治疗一直是困扰皮肤科和整形外科的难题。要从根本上预防和治疗瘢痕,寻求新的方法和技术已经成为创伤修复研究与揭示瘢痕产生、发展等内在规律的关键。以二次谐波产生和多光子激发荧光作为信号源的多光子显微技术,因其对组织微结构的高灵敏度和高空间分辨成像、对生物组织的低杀伤性和成像深度深等特点,而在生物医学领域得到了广泛的应用。通过对瘢痕研究进展的综述,探讨基于双光子激发荧光和二次谐波产生的多光子显微成像技术用于瘢痕研究的关键问题和应用前景。这种技术有望实现在临床医学中通过早期无损探测和实时监测等方式对病理性瘢痕进行预防和治疗,从而解决由于理想的实验动物模型的缺乏而限制人类对病理性瘢痕的临床和实验室的研究进展问题。

双光子激发荧光共振能量转移均相检测DNA

传统的单光子激发FRET模式下，当用紫外光或可见光激发能量供体时，常常会受到生物分子自身荧光和散射光的干扰。而且，在供体的有效激发波长下常常会造成对受体的直接激发。所以，目前FRET方法的发展，迫切需要选择合适的能量供．受体对。近些年来，双光子激发在生物应用方面引起了人们广泛地关注。双光子激发是指某些物质在强光激发下，能同时直接吸收两个光子跃迁到高能态的现象。

碘代甲烷多光子激发色散荧光谱

采用色散荧光光谱方法,对308 nm强激光作用下CH3I分子的激发解离过程进行了实验研究.首先对所得色散荧光谱进行了归属,由此确定了主要的荧光产物粒子;依据荧光信号强度随入射激光能量的变化关系,研究了各碎片粒子的产生、激发及荧光跃迁过程,确定了对应的反应通道.所得结果对其他多原子分子的激发解离研究具有参考价值.

用双光子激发荧光进行单分子探测的实验研究

介绍自行研制的基于飞秒激光双光子激发荧光的单分子探测谱仪，以及对水溶液中香豆素４４５（Ｃ４４５）分子的初步实验结果。

基于双光子激发的荧光相关谱测量

本文利用多光子激发激光扫描显微镜的部分光路和探测器,建立了双光子荧光相关谱系统(Two-PhotonFluorescenceCorrelationSpectroscopy,简称TP-FCS)。利用TP-FCS系统观察到了"光子爆发"现象,实现了染料分子的双光子激发,测量出若丹明B染料分子在蔗糖溶液中的扩散系数。实验证明该系统具有操作简便、可靠性高、费用低廉等特点,可实现单分子检测。

C_(3V)对称性分子多光子激发的同位素效应

用二次量子化方法和酉变换得到ＸＹ３分子伸缩振动的Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ算子，其中的系数优化后用来计算ＮＨ３和ＮＤ３分子的本征能量，其结果与实验值相符。利用这个简单的Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ算子计算了在激光场中ＮＨ３和ＮＤ３分子的多光子激发。详细讨论了跃迁概率的长时间平均值和同位素效应。

供体与受体双光子激发吸收截面比值的测量

针对供体和受体浓度比恒定为1:1的供体受体对,提出了一种利用荧光共振能量转移(FRET)原理测量受体和供体双光子激发吸收截面比值的新方法.由于采用双通道荧光比率测量技术,该方法消除了荧光基团浓度、激发光强度波动、激发区域的不均匀性以及随机杂散信号等因素对测量的影响.利用该方法在活体HeLa细胞中测量了钙离子探针Cameleon(YC2.1)中的受体YFP和供体CFP在710～930nm波长范围内的双光子激发吸收截面之比。

激光脉冲双光子激发方法测量Xe原子能级的寿命

本文报导Xe原子4f5/22,4f3/22两个能级寿命的首次测量。实验采用方向相反的两束脉冲激光进行双光子激发,以达到单光子禁戒及单光子能量所不及的高能态,同时避免了多普勒效应和受激辐射的影响,提高了能级的分辨率和实验精度。1.Xe原子的双光子跃迁 多光子过程是辐射场与原子相互作用的过程。用一束或波长相同的两束偏振光进行激发时双光子激发的跃迁几率为:

多光子激发技术及其在生命科学中的应用

多光子激发技术是２０世纪９０年代初发展起来的新技术，其研究和应用前景十分广阔，本文对多光子激发的原理、优缺点以及近年来它的应用领域作了简介。

高功率激光作用下多光子激发Cs_2的新扩散带辐射

本文报告当λ＝１．０７５６ｍ的强激光作用于铯金属蒸气时，获得了从波长４１０ｎｍ到４７３ｎｍ的准连续的新的辐射带，它在４１２．７ｎｍ、４２１．５ｎｍ、４３３．１ｎｍ、４４５．２ｎｍ、４４６．６ｎｍ及４６０．６ｎｍ等处有较高的强度，初步分析表明这个准连续辐射带是来源于Ｃｓ２的新扩散带，这是迄今首次获得的Ｃｓ２的一个新的谱带实验结果。