高光学纯度乳酸菌株的筛选及发酵性能研究

从不同地区的土壤、泡菜中分离筛选出了2株高光学纯度D-乳酸菌株和2株高光学纯度L-乳酸菌株。通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,确定L-乳酸产生菌HA7-5菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium),HJ57菌株为格氏乳球菌(Lactococcus garvieae);D-乳酸产生菌HB49-2菌株为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii),HL64-1菌株为假肠膜明串株菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)。经摇瓶发酵产酸培养,菌株HA7-5和HJ57发酵产L-乳酸分别达71.83 g/L和31.89 g/L;菌株HB49-2和HL64-1发酵产D-乳酸分别达73.14 g/L和62.04 g/L,且菌株HL64-1发酵周期仅为24 h,产酸速率快,平均产酸速率为2.58 g/(L·h)。D体和L体光学纯度均达99.8%(ee)以上。以上菌株均为产高光学纯度L-或D-乳酸野生型菌株,可作为后期诱变育种的出发菌株,进行菌株改良及发酵性能提升的研究。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中乳酸的光学纯度

以 2 ,3,6 三甲基 β 环糊精作手性流动相添加剂 ,C18柱为固定相 ,考察了流动相的pH和手性流动相添加剂浓度对乳酸对映体分离度的影响 ,建立了DL 乳酸的拆分定量分析方法。用归一化法分析DL 乳酸时引入了定量校正因子 ,确定了外标法测定L 乳酸的回归方程、精密度和回收率。测定了米根霉L 乳酸发酵液中D 型异构体的质量分数及其随放置时间的变化情况。

手性仲丁胺的制备拆分和光学纯度的测定

为了获取仲丁胺的两种光学纯对映异构体 ,采用D 或L 酒石酸作为拆分试剂 ,经过多次结晶 ,分别得到S ( +) 仲丁胺·L ( +) 酒石酸盐和R ( -) 仲丁胺·D ( -) 酒石酸盐晶体 ,从而成功实现了其分离 .产物的光学纯度通过用光活性(R) 联萘酚磷酰氯衍生成 (R) 联萘酚磷酰胺后 ,经3 1PNMR测定 ,o .p .>99% ,拆分剂D 或L 酒石酸经过强酸型阳离子交换树脂 ( 0 0 1× 7× 7型 )方便回收 ,回收率 >80 % .

手性高效液相色谱法测定SR-生物丙烯菊酯对映体的光学纯度

在自制的球形氨丙基硅胶上涂敷纤维素 三 (3,5 二甲基苯基氨基甲酸酯 ) (CDMPC) ,制备了手性固定相(CSP)。用该固定相优化了生物丙烯菊酯对映体的分离条件 ,利用色谱峰面积测定了 3种SR 生物丙烯菊酯对映体的光学纯度。结果表明 ,在CDMPC CSP上用高效液相色谱法 (HPLC)测定SR 生物丙烯菊酯对映体的光学纯度。

衍生化HPLC法测定α-苯乙胺的光学纯度

用4-甲氧基苯甲酸将手性对映体α-苯乙胺衍生化,产生相应的非对映体衍生物。以正己烷、异丙醇或乙醇为流动相,在DNB-pg手性固定相上对α-苯乙胺的对映体衍生物进行了拆分,考察了流动相组成和柱温对该对映体衍生物分离的影响,获得较好的分析条件,分离因子可达1.3以上。该结果进一步与旋光仪方法的测定比较,结果相当一致,相对偏差不超过1.2%。

柱前衍生化高效液相色谱法测定乳酸的光学纯度

用苯胺将乳酸衍生化,得到的对映体衍生物在DNB-Leucine柱上进行了拆分,建立了一种用柱前手性衍生化结合手性固定相正相高效液相色谱法检测乳酸光学纯度的方法,并考察了流动相组成和柱温对其分离的影响。分离结果经二极管阵列紫外检测器检测,以及与对照品比较得到确认。当流动相为V(正己烷)∶V(乙醇)=90∶10,温度为25℃,流速为1.5 mL/min时,乳酸达到基线分离,分离因子达1.30以上。将此法测定乳酸光学纯度的结果与旋光仪方法测定的结果进行比较,相对偏差不超过2%。本方法可用于乳酸对映体的光学纯度准确检测。

柱前手性衍生化-HPLC法测定普瑞巴林的光学纯度

目的：建立柱前手性衍生化-HPLC法测定普瑞巴林的光学纯度。方法：以N^2-（5-氟-2，4-二硝基苯基）-L-丙氨酰胺为手性衍生化试剂，对普瑞巴林S／R对映体进行衍生化，生成具有紫外吸收的一对非对映体衍生化产物（λmax=339nm），经C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm），0．5％三乙胺溶液（用磷酸调节pH至3．0）-乙腈（55：45）为流动相进行分离，测定普瑞巴林的光学纯度。结果：所形成的普瑞巴林非对映体衍生化产物稳定且分离良好，R-异构体浓度在0．20～2．02μg／mL范围内与其衍生化产物峰面积呈良好的线性关系（r=0．9996），加样回收率为96．3％，最低检测浓度为0．02μg/mL。结论：所建立方法快速、灵敏、重复性好，可用于普瑞马林光学纯度的检查。

氨氯地平的毛细管电泳手性拆分及其左旋体的光学纯度分析

选择毛细管电泳技术对 (± ) -苯磺酸氨氯地平进行手性拆分。确定最佳条件为 :2 0 cm× 5 0μm未涂层石英毛细管 ,75 mmol/L磷酸盐缓冲液 (p H 2 .5 ,内含 5 mm ol/L CM-β- CD) ,运行电压 12 k V,毛细管柱温 2 5°C,压力进样6 9k Pa· s,检测波长 2 0 0 nm。对国产 S- (- ) -苯磺酸氨氯地平片进行了光学纯度检查 ,3批样品中 S- (- ) -氨氯地平的光学纯度 (峰面积百分含量 )均大于 99.8%。

柱前衍生化高效液相色谱法准确测定2-氯丙酸的光学纯度

用1-萘胺对2-氯丙酸进行柱前衍生化,衍生化反应在30℃条件下进行10min或更长时间。选择ChiralcelOD-H色谱柱和正己烷-醇类为流动相,考察了流动相组成和柱温的变化对2-氯丙酸衍生物对映体拆分效果的影响。确定流动相为V(正己烷):V(甲醇):V(乙醇)=50:45:5,流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长224nm为较优分析条件,分离因子2.5,8min内出峰。现有文献和试剂手册提供的2-氯丙酸的比旋光度标准值之间相差很大,在实际测量和计算中无准确标准可依。柱前衍生化结合手性固定相色谱方法灵敏度高,重现性好,操作较简单,可用于准确测量2-氯丙酸的光学纯度,并准确给出一定条件下2-氯丙酸的比旋光度和光学纯度的对应关系([α]D20-13.94(neat,d1.2547),e.e.97.9%)。

3种芳香连二醇对映体的毛细管区带电泳手性拆分及其光学纯度分析

以磺化环糊精为毛细管区带电泳(CZE)手性选择剂,成功地分离了3种烯烃的不对称二羟化产物苯基乙二醇、β-甲基苯基-乙二醇和1,2-二苯基乙二醇对映体;考察了不同手性选择剂及其浓度、背景电解质pH值、操作电压等因素对分离的影响,优化了分离条件;对该3种芳香连二醇对映体样品进行了光学纯度检查,并与HPLC测定结果作比较,评价该方法的准确性。结果表明:两批样品中对映体过量(ee)测定值与HPLC法结果相一致,CZE方法简单、准确、分离度好,可用于该芳香连二醇中性化合物的手性拆分和ee值的测定。

二氯菊酸光学纯度的毛细管气相色谱法测定研究

使用以 2 ,6 -二 - O-戊基 - 3- O-丁酰基 -β-环糊精作手性固定相制成的毛细管手性柱 ,用气相色谱法在 12 0℃成功地分离了外消旋二氯菊酸甲酯对映体 ,其中对顺、反外消旋二氯菊酸甲酯对映体的手性分离因子分别达到 1.0 3和 1.0 4 ,均大于测定光学纯度 (e.e.% )值所要求的 1.0 2。测定了 4种手性二氯菊酸甲酯的光学纯度 ,方法简便易行 。

高效液相色谱法测定肾上腺素的光学纯度

用2，6-二甲基-β-环糊精作手性流动相添加剂，C18柱为固定相，建立了D，L-肾上腺素拆分的定量分析方法。用归一化法分析D，L-异构体时引入了定量校正因子。比较了外标法和内标法定量测定L-肾上腺素的回归方程、精密度及回收率。测定了不同储存期的L-肾上腺素滴眼剂中D型异构体的质量分数。

毛细管电泳法手性拆分苯磺酸氨氯地平及其光学纯度分析

采用毛细管电泳法拆分苯磺酸氨氯地平手性对映体并检测其光学纯度,选择CM-β-CD为手性选择剂,考察了CM-β-CD浓度和缓冲液pH值对手性分离的影响,并对分离条件进行了优化。实验结果表明,在不添加任何有机改性剂的条件下,含10 mmol/L CM-β-CD的50 mmol/Ltris-磷酸缓冲液(pH值为2.5)可使对映体在短时间(7.22 min)内完成基线分离,分离度(RS)达4.3。

注射用还原型谷胱甘肽钠的毛细管区带电泳分离及其光学纯度分析

运用毛细管区带电泳(CZE),以pH=6.59的60mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4作为电泳缓冲溶液,测定波长为200nm,还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)于5min内达到基线分离。GSH和GSSG的线性范围分别为4～1 000μmol/L和2～1 000μmol/L,相关系数R2值均为0.9999,迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别小于0.58%和2.30%,GSH和GSSG的检出限分别为1.66μmol/L和0.86μmol/L,回收率在95.4%～103.3%之间,相对标准偏差均小于3.05%(n=3)。建立的新方法用于市售注射用还原型谷胱甘肽钠的分析,测得注射用还原型谷胱甘肽钠中GSSG含量为0.47%,光学纯度为99.53%。

N-酰基丙氨酸类杀菌剂光学纯度的色谱分析

报道了旋光性Ｎ－酰基丙氨酸类杀菌剂光学纯度的色谱分析方法。光学活性杀菌剂的合成中间体Ｎ－（２，６－二甲苯基）－丙氨酸与ｌ－薄荷醇在催化剂作用下，生成非对映异构体的薄荷醇酯。经薄层色谱纯化，用高效液相色谱进行分析，即可确定中间体的光学纯度。光学纯度一定的中间体经合成至最终产物，其光学纯度不变。

萘普生及其酯类的手性分离和光学纯度测定

以磺化β－ 环糊精作为手性分离添加剂， 分别对萘普生、萘普生甲酯和萘普生氯乙酯进行了毛细管电泳手性分离研究， 当以含４０ ｇ／Ｌ 的磺化β－ 环糊精的０ ．０１０ ｍｏｌ／Ｌ 的三羟甲基氨基甲烷－ 柠檬酸为缓冲液（ｐＨ５．０） 时，上述３ 种化合物的手性分离度分别为２ ．１９ 、２ ．６０ 和１ ．９９ 。 手性化合物的出峰时间和校正峰面积的相对标准偏差分别为２ ．８４ ％ 和６ ．２６％ ， 而两对映体的相对出峰时间和相对校正峰面积的相对标准偏差分别为０ ．５２ ％和１ ．８６ ％ 。 对萘普生和萘普生氯乙酯的实际样品进行了光学纯度测定， 测定结果与ＨＰＬＣ 进行了比较。

质谱中的立体化学效应（19）──对映异构的α－苯乙胺光学纯度质谱测定

质谱中的立体化学效应（１９）──对映异构的α－苯乙胺光学纯度质谱测定吴忆南，涂亚平，潘远江，陈耀祖（浙江大学化学系，杭州，３１００２７，兰州大学应用有机化学国家重点实验室）崔勐，宋凤瑞，刘淑莹（中国科学院长春应用化学研究所）关键词对映体，光学纯度，质...

超高效合相色谱法测定l-OTS的含量及光学纯度

目的建立l-OTS的含量测定及光学纯度检查的超高效合相色谱法(UPC^2)。方法使用ACQUITY UPC^(2TM)Trefoil^(TM)AMY1手性色谱柱(3.0 mm×50 mm,2.5μm),柱温30℃,以超临界CO_2和0.2%二乙胺的异丙醇(95∶5,体积比)为流动相,流速为1.0 m L/min,检测波长227 nm(补偿参比为310~360 nm),采用对照品法进行定量测定。结果 l-OTS与其对映异构体(d-OTS)有效分离,分离度为2.30,在40~1 000 mg/L范围内峰面积对应质量浓度呈良好的线性关系(r=0.999 9,n=7),平均加样回收率为99.8%(n=9),样品在24 h内稳定(RSD=0.81%),最低检测限5 ng(S/N=4)。结论此方法简便、迅速,经方法学验证可用于l-OTS的含量测定及光学纯度分析。