小麦光敏色素基因TaPhyB3的克隆和表达分析

从小麦品种中国春中克隆了编码光敏色素基因B的脱辅基蛋白,将其定位于4D染色体的长臂上,并命名为TaPhyB3。TaPhyB3的开放阅读框为3501bp,编码一个128kD、具有1165个氨基酸的蛋白质。它与水稻、玉米和拟南芥在氨基酸水平上的一致性分别为93%、90%和73%。对不同光线处理7d小麦植株表达的分析表明,TaPhyB3在黑暗中表达最低、在白光下的表达水平最高,在远红光、红光、蓝光和白光下的表达水平分别是黑暗中的2.2、7.7、7.4和37.3倍。组织特异性表达分析表明,TaPhyB3在小麦幼苗所有组织中都表达,叶片中的表达水平是根的11.4倍。推测TaPhyB3的表达水平与小麦的光形态建成的程度呈正相关。

花生光敏色素AhphyA和AhphyB基因的克隆及原核表达研究

【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。

茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术在茎瘤芥幼苗叶片中克隆了茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段,命名为BjPHYB1(GenBank登录号:JQ178243)。结果表明,该片段长1 544 bp,编码514个氨基酸;该氨基酸序列包含两个完整的PHYB保守结构域PHYTOCHROMEREGION和PAS DOMAIN,且与甘蓝和拟南芥PHYB同源性分别为98%和96%;系统进化树分析表明BjPHYB1与同科植物的PHYB亲缘关系较近。茎瘤芥PHYB基因片段为首次克隆,为今后对该基因功能研究奠定了基础。

甘蓝型油菜光敏色素(PHY)家族基因的鉴定及表达分析

光敏色素(phytochrome,PHY)作为植物体内感受红光和远红光的受体,在植物的避荫反应及生物、非生物胁迫响应中起重要的调节作用。鉴定甘蓝型油菜中PHY家族基因并解析其分子机理,有助于提高油菜光能利用率,培育抗逆性强、适合密植直播和机收的油菜品种。为了研究PHY基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的家族特征,以5个拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtPHY基因为基础序列,在甘蓝型油菜、甘蓝(B.oleracea)、白菜(B.rapa(Lour.)Rupr.)、黑芥(B.nigra)、芥菜型油菜(B.juncea)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)中分别鉴定出11个、6个、5个、5个、10个和9个PHY基因。生物信息学分析结果显示PHY基因在芸薹属中高度保守。在甘蓝型油菜11个BnaPHY基因中,PHYA亚组成员主要在根中表达,PHYB亚组主要在叶片中表达。此外PHYA和PHYB均显著受高温和低温胁迫的调控,而非生物胁迫和激素处理对PHY基因表达的影响不明显。春化处理中的PHYB亚组表达量下调,PHYC和PHYE亚组表达量则上调,而在PHYA亚组只有部分基因表达量上调。大部分PHY基因表达明显受核盘菌抑制,有两个PHYA成员的表达明显受核盘菌诱导。

栽培黑麦光敏色素PHYA、PHYB和PHYC基因转录丰度对不同光质处理的响应

栽培黑麦(Secale cereal L.)属于禾本科黑麦属,是一种有价值的粮食和饲料作物,对生物和非生物胁迫具有很高的抗性。黑麦1RS染色体臂携带的抗病基因通过染色体易位转入小麦基因组,1BL/1RS易位系在世界范围内提高了小麦对白粉病和条锈病抗性。光敏色素是一类红光/远红光受体,调控植物的种子萌发、株高、避荫性反应和开花等适应性反应。本试验克隆了黑麦光敏色素基因(phytochrome)ScPHYA、ScPHYB和ScPHYC,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析ScPHYs在不同组织中的转录丰度,及其在幼苗期对不同光质和光周期处理的响应。研究发现,黑麦与拟南芥、水稻及普通小麦等植物的phys蛋白具有相似的结构域,且与小麦、水稻等禾本科植物的phys蛋白有较高的氨基酸序列一致性,暗示它们可能具有相似的功能。ScPHYs在根中的表达水平最高,并在黑暗和远红光条件下的转录丰度较高;由黑暗转红光、远红光、蓝光和白光条件下三者的表达模式略有不同。在光周期反应中,长日照条件下三者的表达模式相似,短日照条件下三者的表达模式各不相同。以上结果表明,ScPHYs可能在黑麦光形态建成中发挥重要功能。本文通过对3个黑麦光敏色素基因的转录分析,为研究黑麦的光信号系统提供参考,同时也为进一步探究光敏色素在黑麦遗传改良及分子育种中的应用提供依据。

两种策略分别克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因

短日照是苜蓿秋眠性的主要影响因子,故苜蓿秋眠被认为是一种光周期反应。光敏色素是光周期反应的主要受体,因而探究光敏色素与苜蓿秋眠性之间的关系可能是揭示苜蓿秋眠性机理的有效途径之一。紫花苜蓿光敏色素A、B基因尚未被克隆,本研究采用2种不同的试验策略,分别以mRNA和基因组DNA为起点,根据比较基因组学原理和生物信息学方法,利用RACE和染色体步移等手段,克隆得到了紫花苜蓿光敏色素A全长和光敏色素B近全长基因序列,为进一步探讨两者在苜蓿生长发育,特别是苜蓿秋眠性的光周期调控机制中的作用奠定了基础,并为克隆紫花苜蓿其他未知基因等研究提供思路和参考。

水稻光敏色素相互作用因子基因OsPIL11的表达模式及其在光信号传导中作用的初步分析

分析了OsPIL11基因(6个潜在的PIF转录因子之一)的表达模式,结果表明OsPIL11在水稻中的表达具有器官特异性,并且受叶片发育、脱落酸、茉莉酮酸和水杨酸调控。为了进一步分析OsPIL11在植物光信号传导中的作用,构建了OsPIL11基因的过量表达载体,并将其转化至烟草。通过比较转基因和野生型烟草植株幼苗在红光和远红光下的光形态建成特征,发现红光下生长的OsPIL11转基因烟草下胚轴较短、真叶和子叶较大;然而在远红光下,转基因和野生型烟草植株的表型没有差异。这些结果表明,OsPIL11参与红光诱导的幼苗去黄化反应,但是不参与远红光诱导的幼苗去黄化反应。

水稻光敏色素A和B的突变对气孔发育和OsAQP基因表达的影响

OsAQP是在水稻叶片保卫细胞中高表达的液泡膜型水通道基因,为研究该基因在水稻发育过程中的表达与光敏色素光信号通路的关系,观察统计了日本晴、光敏色素突变体phyA和phyB 3个水稻品种的生长发育特征,比较了开花时间、叶片气孔密度、气孔器长等指标,并采用半定量RT-PCR以及实时定量PCR技术检测OsAQP基因在3种材料不同时期叶片中的表达特性。结果显示,光敏色素突变体phyB叶片的气孔密度、气孔器长度均低于同时期的日本晴和光敏色素突变体phyA水稻,说明光敏色素B及其相关信号可能与气孔的发育关系密切;表达模式分析显示,OsAQP基因在3个水稻品种的叶片中具有不同的表达特性,并伴随发育时期呈现下降的趋势。本研究结果说明水稻光敏色素B以及相关信号不仅与气孔的发育有关,而且可能通过与光敏色素A及相关信号通路共同调节OsAQP基因的表达,参与气孔开闭的调节。

光敏色素与转录因子结合直接调控植物基因表达和发育

植物的光控发育一直是植物学中一个非常活跃的研究领域。最近该领域又取得重大突破性进展，人们通过酵母双杂交技术克隆到在体内与光敏色素相互作用的转录因子，并证实被光活化的光敏色素直接进入细胞核与转录因子结合启动基因表达。本文就此研究进展作简要介绍。

甘蓝型油菜光敏色素互作因子4(BnaPIF4)基因克隆和功能分析

光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, PIF4)是光信号途径关键转录因子, PIF4与BZR互作介导光信号与油菜素内酯信号互作,参与植物光响应。本文在甘蓝型油菜湘油15号中克隆到2个PIF4基因,分别定位于A03号染色体和C03号染色体,命名为BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03,全长编码序列(coding sequence, CDS)、全长mRNA和全长基因分别为1242 bp和1245 bp、1701 bp和1731 bp、2527 bp和2665 bp,各自编码413和414个氨基酸。BnaPIF4_A03具有7个外显子和6个内含子, BnaPIF4_C03具有8个外显子和7个内含子,与测序品种中双11号相比, BnaPIF4_A03基因第1内含子存在单碱基插入突变,第4和第6内含子存在缺失突变,且具有更长的3'-UTR,两基因其他序列在湘油15号和中双11号之间无差别。BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因编码蛋白具有典型的植物bHLH结构域,亚细胞定位于细胞核,是典型的植物PIF4蛋白。多序列比对和进化分析表明, BnaPIF4蛋白与白菜、拟南芥、亚麻芥等PIF4蛋白高度同源。PIF4蛋白进化关系与物种进化关系一致,近缘物种中的PIF4蛋白在进化树中高度聚类,大量植物中可见PIF4蛋白重复且低等植物中分化程度明显低于高等植物中,表明PIF4蛋白是一个晚期进化事件且可能存在功能冗余。酵母杂交实验表明BnaPIF4与BnaBZR蛋白存在互作,但BnaPIF4不能与BnaBZR基因的启动子互作,表明BnaPIF4与BnaBZR在蛋白水平而非转录水平发生互作。湘油15号中BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因表达规律一致,BnaPIF4基因主要表达于油菜茎表皮、未成熟角果和叶中,在花和根中表达较低,且其表达随油菜生育进程逐渐降低。

光敏色素基因与作物改良利用

基因克隆、基因功能研究、作物转基因以及遗传育种的有效结合,对棉花等作物新品种的选育具有推动作用。在作物改良利用的基因中,光敏色素基因是一类重要的光信号传递基因,是主要的红光和远红光的光信号受体,与植物的整个生长发育过程紧密相关。详述了近年来光敏色素基因的功能、结构等方面的研究进展,对深刻研究了解植物光信号转导途径所调控的植物发育具有积极意义。

光敏色素的基因家族与表达调控

概述了植物体内光敏色素分子的种类、基因家族及其表达与调控，并简要介绍转基因技术在研究光敏色素基因家族中的应用。

水稻OsMPK14基因在光敏色素A和B突变体中的差异表达特性

以日本晴(Wt)和光敏色素A、B的突变体(phyA,phyB)3个水稻(Oryza stiva L.)粳稻品种为试材,检测其在生长发育过程中叶片组织的叶绿素含量,并采用半定量RT-PCR和实时定量PCR技术,检测水稻MAPK基因OsMPK14在叶片中的表达特性。结果表明,在水稻生长发育过程中,光敏色素A和B的突变叶片叶绿素含量呈下降趋势;表达模式分析显示,OsMPK14基因在3个水稻品种的叶片中具有不同水平的表达,在Wt和phyA植株叶片中的表达呈现出波动性,而在phyB中随着生长进程的延续呈上升趋势。

光敏核不育水稻光敏色素基因的RFLP分析

以籼稻“ＩＲ３６”（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）光敏色素基因ｐｈｙＡ 的ｃＤＮＡ 克隆作探针，对光敏核不育水稻“农垦５８Ｓ”和对照水稻“农垦５８”（Ｏ．ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）进行ＲＦＬＰ分析，限制性内切酶Ｅｃｏ ＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＸｂａⅠ、ＭｓｐⅠ等都没有显示出多态性，而用ＨｐａⅡ显示出了多态性。ＭｓｐⅠ和ＨｐａⅡ是一对同裂酶（识别位点为ＣＣＧＧ），但二者对识别位点上第２个胞嘧啶（即ＣｐＧ）甲基化的敏感性不同。实验结果表明，“农垦５８Ｓ”ｐｈｙＡ 基因中ＣｐＧ甲基化程度低于“农垦５８”，即在“农垦５８Ｓ”ｐｈｙＡ 基因中某些ＣｐＧ 发生了脱甲基化。此外，以“ＩＲ３６”、“农垦５８”、“农垦５８Ｓ”的ＤＮＡ 作模板，用ＰＣＲ方法在ｐｈｙＡ 基因转录起始位点上游扩增出一大小均为０．４ ｋｂ 的ＤＮＡ片段（称为ＰＣＲＦ）。测序结果表明，“农垦５８Ｓ”的ＰＣＲ２ 比“ＩＲ３６”的ＰＣＲ１ 多一个碱基，且另有８ 个碱基不同。以“ＩＲ３６”的ＰＣＲＦ作探针进行ＲＦＬＰ分析，在“农垦５８Ｓ”和“农垦５８”中杂交得到的片段都不同于“ＩＲ３６”中得到的片段。根据“ＩＲ３６”ｐｈｙＡ基因?

茶树光敏色素基因家族成员的生物信息学及其表达量与黄酮含量的相关性分析

【目的】分析茶树光敏色素(PHY)基因(CsPHY)的生物学信息及不同采摘时间点茶叶中光敏色素基因表达量与黄酮含量的相关性,为茶叶适时采摘及品质调控提供理论参考。【方法】从茶树基因组数据库(CSA)中筛选出CsPHY基因家族成员,对其进行生物信息学分析,并通过邻接法(NJ)构建系统发育进化树。以一天中不同时间点0:00(R0)、6:00(R6)、12:00(R12)和18:00(R18)采摘的乌龙茶品种肉桂鲜叶为试材,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CsPHY基因家族成员在不同时间点的表达量,并采用三氯化铝比色法检测茶叶中黄酮含量的日变化,以皮尔逊(Pearson)相关系数评估CsPHY基因相对表达量与黄酮含量的相关性。【结果】共筛选获得6个CsPHY基因家族成员,编码蛋白的氨基酸数量674~1142个,分子量为76126.75~126714.53Da,等电点(pI)为5.74~5.96,脂溶性系数为91.11~95.27,其中,CsPHY1基因属于PHYC亚族,CsPHY2和CsPHY4基因属于PHYA亚族,CsPHY3和CsPHY5基因属于PHYB亚族,CsPHY6基因属于PHYE亚族,说明CsPHY2和CsPHY4蛋白属于PhyI型光敏色素,CsPHY1、CsPHY3、CsPHY5和CsPHY6蛋白属于PhyII型光敏色素。6个CsPHY蛋白均与双子叶植物PHY蛋白的亲缘关系较近,其中,CsPHY2蛋白与水晶兰PHYA亚族蛋白的亲缘关系较近,CsPHY4蛋白与美味猕猴桃PHYA亚族蛋白的亲缘关系较近;CsPHY3和CsPHY5蛋白均与美味猕猴桃PHYB亚族蛋白的亲缘关系较近,且CsPHY5蛋白与葡萄PHYB亚族蛋白的亲缘关系相近;CsPHY1蛋白与河岸葡萄PHYC亚族蛋白的亲缘关系较近,CsPHY6蛋白与中华猕猴桃和河岸葡萄PHYE亚族蛋白的亲缘关系较近。CsPHY1、CsPHY3、CsPHY4和CsPHY5基因在R6时的表达量最高,其中,CsPHY4和CsPHY5基因在R6时的表达量显著高于其他时间点的表达量(P<0.05,下同),而CsPHY2和CsPHY6基因分别在R12和R18时的表达量达最高,其中CsPHY6基因在R18时的表达量显著高于R12时的表达量。在R0~R18时段内茶树鲜叶中的黄酮含量无显著变化(P>0.05),整体呈先下降后上升趋势,在R18时达最高值,在R12时最低值。6个CsPHY基因家族成员中,仅CsPHY6基因与黄酮间呈极显著正相关(P<0.01)。【结论】CsPHY基因家族中仅缺少PHYD亚族成员,尽管各成员间功能结构较相似,但表达模式存在明显差异。光照影响茶树叶片中黄酮含量,CsPHY6基因编码的光受体蛋白CsPHY6参与调控茶树叶片中的黄酮含量。

一个光敏色素B调控的水稻NBS-LRR基因的表达模式分析

利用水稻基因芯片比较野生型、phyA和phyB突变体受连续红光照射后的基因表达图谱,从中筛选到一个受光敏色素B(phyB)介导的红光信号特异诱导的、编码NBS-LRR类蛋白的基因,命名为PB-LRR(phyB-regu lated NBS-LRR)。为了揭示PB-LRR基因在水稻生长发育中的作用,对该基因表达的器官特异性及其对不同激素的应答反应进行了分析。结果表明,PB-LRR基因在叶中表达水平最高,在茎中最低。光对PB-LRR基因表达的诱导是由phyB调控的,与phyA无关。此外PB-LRR基因的表达受外源ABA的抑制,并且受环境因子的调控。构建PB-LRR启动区∶GUS植物表达载体,转化至野生型和phyB突变体中,GUS染色结果表明,在phyB突变体转基因植株中的GUS活性明显低于野生型,而且GUS活性主要出现在叶片上部。这表明PB-LRR基因的表达不仅受phyB介导的光信号调控,而且受发育调控。本研究结果为进一步分析PB-LRR基因在phyB介导的光反应和水稻抗病反应中的作用奠定了基础。

谷子光敏色素家族基因的生物信息学及表达模式分析

光敏色素(PHY)是植物体重要的光感受器,在光形态建成中发挥重要作用。为挖掘新型模式植物谷子的光敏色素基因,通过BLAST从xiaomi基因组中共鉴定出4个SiPHYs,命名为SiPHY-1、SiPHY-2、SiPHY-3、SiPHY-4。利用生物信息学方法对SiPHYs的基因结构、理化性质、系统进化、启动子顺式作用元件和不同时期不同组织的表达谱进行分析,并采用RT-qPCR分析6个品种(系)在不同光周期下SiPHYs差异表达。结果表明,4个SiPHYs分布在8号和9号染色体上,除SiPHY-2外其余3个成员均为酸性亲水性蛋白;系统进化显示,SiPHY-1和SiPHY-2为PHYA亚族,SiPHY-3为PHYB亚族,SiPHY-4为PHYC亚族,且SiPHYs与狗尾草SvPHYs、玉米ZmPHYs、高粱SbPHYs的亲缘关系近,与拟南芥AtPHYs亲缘关系较远;SiPHYs的顺式作用元件中光响应元件占比最多。表达谱分析结果显示,SiPHY-1可能与谷子的种子萌发有关,SiPHY-3可能与谷子形态建成有关,SiPHY-4可以调控谷子的抽穗开花期;进一步对6个品种(系)不同光周期下的差异表达显示,SiPHY-1在晋谷21和大同红谷中差异显著,SiPHY-3在大同红谷中差异显著,SiPHY-4在晋谷21、xiaomi、黄粟和xiaomi4中差异显著,而SiPHY-2在不同光周期和不同材料中表达量均很低或不表达,说明SiPHY表达量受光周期和基因型的影响。

草地早熟禾光敏色素作用因子基因PpPIFs的鉴定与表达分析

草地早熟禾(Poa pratensis)是世界上应用广泛的草坪草种,其优异基因的挖掘对新品种的选育具有重要意义。光敏色素作用因子(PIF)基因是植物特有的转录因子之一,在植物生长发育和逆境胁迫中起到重要作用。本研究从草地早熟禾转录组数据库序列中比对分析得到4个PpPIFs基因的cDNA全长序列,具有完整的开放阅读框。运用生物信息学方法预测PpPIFs家族成员的理化性质和保守结构域,发现4个PpPIFs转录因子都是酸性蛋白,亚细胞定位都在细胞核中,通过聚类分析可将4个PpPIFs成员分为3类。对干旱胁迫下不同时间点叶片中的PpPIFs进行实时荧光定量PCR。结果显示,PpPIF1、PpPIF3和PpPIF4在干旱胁迫8 h时均显著上调表达,而在干旱胁迫96 h时PpPIF1、Pp⁃PIF3和PpPIF5均表现为上调。对草地早熟禾不同组织的PpPIFs基因进行表达分析发现,分蘖枝中PpPIF1、PpPIF3和PpPIF4的相对表达量显著高于叶片中的相对表达量,而4个PpPIFs基因在根系中的相对表达量均显著低于叶片中的相对表达量。PpPIF1和PpPIF3可能参与调控草地早熟禾分蘖芽伸长生长和抗旱性。研究结果可为草坪草生物育种提供优异的基因资源。

棉属光敏色素PHY基因家族的全基因组鉴定与驯化选择分析

光敏色素(PHY)作为植物体内重要的红光(R)和远红光(FR)受体,在调节植物花期、提高作物产量以及调控植物抗逆性方面均具有重要作用。鉴定棉花PHY基因,探究其驯化和改良的遗传调控网络,发掘棉花光敏色素关键基因,为早熟棉花品种的从头驯化和育种提供新见解。以5个拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素基因作为种子序列,利用生物信息学方法,对不同棉种中的PHY基因进行全基因组系统鉴定。系统发育分析表明,锦葵科植物中的PHY基因包括PHYA、PHYB、PHYC与PHYE四个亚家族。PHY基因在陆地棉(Gossypium hirsutum)不同群体间的驯化选择分析结果表明, PHY基因的驯化过程可分为早期驯化和后期遗传改良2个阶段。对陆地棉野生种和栽培品种在长、短日照下的转录组分析显示,GhPHYA1Dt和GhPHYB1Dt在长、短日照下的表达差异显著;在长日照处理14小时后,栽培品种GhPHYC1At和GHPHYE1At的表达量显著低于野生种。研究结果为进一步揭示棉花PHY基因的驯化选择和功能机制奠定了基础,为棉花早熟新品种选育和从头驯化提供了理论依据。

光敏色素在水稻生长发育中的作用

光敏色素是植物体内的重要光受体,主要感受红光和远红光,调节着植物生命循环中许多重要发育过程。水稻光敏色素基因家族包括3个成员,即PHYA、PHYB和PHYC。对水稻光敏色素突变体的研究表明,3个水稻光敏色素基因在水稻光形态建成中既有独特作用又有交叉作用。根据已有报道和作者在该领域的研究工作,总结了光敏色素在水稻幼苗去黄化、根的向地性和延伸、株型、花期和育性等发育过程中的作用,并提出了水稻光敏色素研究领域急需解决的问题。