甘蓝光敏色素B基因的克隆及在拟南芥中异源转基因的功能验证

【目的】甘蓝(Brassica oleracea L.)是世界上最广泛种植的蔬菜作物之一,其种植已由春、秋两季种植转变为四季栽培,因此,研究甘蓝对光温的反应能力是品种改良的重要基础。光敏色素是植物最重要的一类光受体,主要响应远红光和红光的变化,其中,光敏色素B是红光的最主要受体,与光形态建成、避荫性以及生物产量等性状密切相关。克隆甘蓝的光敏色素B基因(Bo PHYB),在拟南芥中验证异源基因Bo PHYB在光形态建成和避荫性反应中的作用,丰富植物光敏色素基因功能研究,评价光敏色素在甘蓝品种改良中应用的潜在价值。【方法】利用RT-PCR的方法克隆、测序验证得到甘蓝自交不亲和系12C的Bo PHYB编码区c DNA序列;利用生物信息学软件分析其编码的氨基酸序列及结构域,并与其他植物的光敏色素B进行序列比对,分析它们之间的同源关系;构建其35S启动子驱动的植物表达载体p JIM19-Myc-Bo PHYB,通过农杆菌介导法转化拟南芥野生型Col-0和phy B-9突变体,并获得纯合转基因株系;比较Bo PHYB与拟南芥光敏色素B(At PHYB-GFP)的转基因株系在不同光质下的下胚轴伸长和成株期的表型,验证其在光形态建成和避荫性反应中的作用。【结果】从甘蓝中克隆了Bo PHYB的编码区c DNA序列,该基因编码区含有3 507个核苷酸,编码具有1 168个氨基酸残基、分子量为128.9 k D的蛋白质;与拟南芥和白菜的phy B结构域类似,Bophy B包含1个GAF结构域、2个PAS结构域、1个His KA结构域和1个HATPase_c结构域;氨基酸序列同源性分析发现,Bophy B与拟南芥以及白菜的phy B同源性最高,与小麦、玉米、水稻等单子叶植物的同源性较低;与At PHYB-GFP类似,在红光和白光下不但Myc-Bo PHYB能互补phy B-9极端黄化的表型,而且转基因株系均表现为下胚轴加剧缩短;长日照和短日照下成株期转基因导致植株矮化、叶片深绿和叶柄缩短。【结论】克隆了甘蓝光敏色素B基因,甘蓝光敏色素B与拟南芥和白菜的光敏色素B具有相似的结构和功能,在红光和白光下促进幼苗的去黄化反应,在成株期显著抑制长日照和短日照下植株的避荫性反应。

光敏色素B在调控水稻苗期株高和生物量中的作用

水稻光敏色素基因家族包括3个成员:PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明,phyB在调节水稻幼苗去黄化、叶角、花期以及非生物胁迫反应中具有重要作用,但是phyB对水稻苗期株高和生物量的影响仍未有报道。本研究比较了野生型和phyB突变体(phyB1和phyB2)在不同培养条件下苗期的株高、鲜重和干重,结果表明,在营养液和基质培养条件下,phyB突变体的株高均显著低于野生型,鲜重和干重与野生型差异并不明显,据此推测,phyB调控水稻苗期株高,但对生物量的影响不明显。利用基因芯片技术,比较了野生型和phyB突变体苗期地上部分的基因表达图谱,筛选到受phyB上调的基因115个,受phyB下调的基因95个;差异基因的GO富集分析结果表明,富集的基因主要参与水稻生长等生物学功能,因此推测通过调控这类基因的表达而影响苗期生长。本研究首次揭示了phyB对水稻苗期株高和生物量的影响,并进一步讨论了phyB在选育机插秧水稻品种中的潜在应用价值。

拟南芥光敏色素B氨基酸位点突变对其结构与功能的影响

生物体为适应外界不断变化的光环境,进化出不同的光受体,其中光敏色素是一类经典的植物感受红光和远红光的受体蛋白,其通过暗适应的Pr状态和光激活的Pfr状态之间的光转换来检测红光和远红光。植物光敏色素具有1个保守的N端感光区域和1个C端调节区域,其中N端部分包括NTE、PAS、GAF和PHY亚结构域, C端部分包括2个PAS结构域和1个组氨酸激酶相关结构域(HKRD)。为深入了解光敏色素的结构及功能,已获得许多光敏色素功能缺失或氨基酸位点突变体,并对其进行功能研究,发现N端结构域在光敏色素的光谱特性、光信号感知和光信号转导等方面均具有重要作用;而C端结构域是光敏色素的二聚化与核定位所必需。该文综述了拟南芥(Arabidopsis thaliana)中光敏色素B (phyB)各亚结构域中氨基酸位点突变对其功能的影响,以期深入理解phyB的结构及功能,为未来通过基因编辑手段进行作物农艺性状的遗传改良奠定基础。

小麦光敏色素基因TaPhyB3的克隆和表达分析

从小麦品种中国春中克隆了编码光敏色素基因B的脱辅基蛋白,将其定位于4D染色体的长臂上,并命名为TaPhyB3。TaPhyB3的开放阅读框为3501bp,编码一个128kD、具有1165个氨基酸的蛋白质。它与水稻、玉米和拟南芥在氨基酸水平上的一致性分别为93%、90%和73%。对不同光线处理7d小麦植株表达的分析表明,TaPhyB3在黑暗中表达最低、在白光下的表达水平最高,在远红光、红光、蓝光和白光下的表达水平分别是黑暗中的2.2、7.7、7.4和37.3倍。组织特异性表达分析表明,TaPhyB3在小麦幼苗所有组织中都表达,叶片中的表达水平是根的11.4倍。推测TaPhyB3的表达水平与小麦的光形态建成的程度呈正相关。

茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术在茎瘤芥幼苗叶片中克隆了茎瘤芥光敏色素PHYB基因片段,命名为BjPHYB1(GenBank登录号:JQ178243)。结果表明,该片段长1 544 bp,编码514个氨基酸;该氨基酸序列包含两个完整的PHYB保守结构域PHYTOCHROMEREGION和PAS DOMAIN,且与甘蓝和拟南芥PHYB同源性分别为98%和96%;系统进化树分析表明BjPHYB1与同科植物的PHYB亲缘关系较近。茎瘤芥PHYB基因片段为首次克隆,为今后对该基因功能研究奠定了基础。

陆地棉(Gossypium hirsutum)光敏色素B基因(GhPHYB)克隆及其生物信息学分析

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥光敏色素B氨基酸序列比对及蛋白结构预测,发现该基因包含植物光敏色素完整的结构,与烟草、拟南芥、水稻、小麦和玉米的氨基酸序列相似性分别为87.2%、77.9%、74.5%、74.5%和54.6%。同时,本研究还构建了Gh PHYB基因的RNAi干涉载体用于转化棉花,并通过构建棉花PHYB RNAi突变体了解陆地棉PHYB基因对棉花株型、开花期、产量、棉纤维品质、抗逆性等方面的调控作用。研究结果可为该基因今后应用于棉花生产奠定基础。

破坏ARF8基因降低拟南芥对红光的敏感性

通过ARF8基因的突变体arf8-1以及arf8-1与红光受体突变体phyB-5所组成的双突变体在红光条件下的表型鉴定,探讨ARF8参与拟南芥对红光的反应以及PhyB与ARF8在红光信号转导中的关系.结果表明,在红光条件下,arf8-1和phyB-5幼苗下胚轴的长度比相应野生型的长,倒伏度比相应野生型的低,而双突变体arf8-1 phyB-5的下胚轴的长度和倒伏度均比两个单突变体的更长和更低.上述结果说明,破坏ARF8基因降低了拟南芥对红光的敏感性,即ARF8参与了拟南芥对红光的反应,但没有介导PhyB所接收的红光信号转导.

红光与远红光比值对盐胁迫下番茄幼苗抗氧化能力的影响

该试验以‘Money Maker’野生型(CK)和以‘Money Maker’为背景的光敏色素B1突变体(phyB1)番茄植株为试材,分析红光与远红光比值(R∶FR)分别为7.4、1.2和0.8的光环境下,受盐胁迫(100mmol·L-1 NaCl)的番茄幼苗根系形态指标及叶和根中渗透调节物质含量、活性氧含量、抗氧化酶活性、MDA含量和相对电解质渗透率的变化,以解释不同R∶FR值对番茄幼苗抗氧化能力的影响以及光敏色素B1在其中的作用。结果显示:(1)在盐胁迫条件下,野生型和突变体phyB1番茄幼苗的根系形态指标(总根长、总根表面积、根尖数、根叉数)比对照显著降低,叶和根中渗透调节物质(可溶性蛋白和脯氨酸)含量、活性氧(O-·2和H2O2)含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、MDA含量和相对电解质渗透率均比对照显著升高。(2)在盐胁迫条件下降低植株生长光环境中的R∶FR值,野生型番茄植株的根系形态指标以及叶和根中渗透调节物质含量及抗氧化酶活性均比盐胁迫下显著升高,叶和根中活性氧含量、MDA含量和相对电解质渗透率均比盐胁迫下显著降低,而在phyB1突变体番茄植株中,以上指标在不同R∶FR值处理间均没有显著变化。研究发现,低R∶FR值能够促进野生型番茄根系的生长,提高叶和根中渗透调节物质含量和抗氧化酶活性,降低叶和根中活性氧含量、MDA含量和相对电解质渗透率,增强野生型番茄幼苗的抗氧化能力,促进番茄幼苗的生长,且当R∶FR值为0.8时整体效果最优;光敏色素B1在低R∶FR值促进番茄幼苗抗氧化能力中发挥了重要作用。