葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母CCTCC M202019能量代谢和丙酮酸积累的影响

在好氧条件下,光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019能够利用葡萄糖酸钠为唯一碳源生长并积累少量丙酮酸。在含有90 g/L葡萄糖的培养基中,16 h时添加10 g/L葡萄糖酸钠,与100 g/L葡萄糖作为唯一碳源的对照组相比,细胞质量浓度、葡萄糖消耗速率、丙酮酸生产强度分别提高7.96%、13.04%和32.81%;其原因在于葡萄糖酸钠的添加,使胞内NAD+浓度提高了29.73%,NADH/NAD+比值和ATP含量分别下降26.89%和8.50%,此变化显著缓解了NADH和ATP对于糖酵解途径的抑制作用,从而显著加快糖酵解速率。

添加TCA循环中间产物加速光滑球拟酵母积累丙酮酸

在维生素限制的条件下 ,研究了添加TCA循环中间产物对光滑球拟酵母多重维生素营养缺陷型菌株CCTCCM2 0 2 0 19生长和积累丙酮酸的影响。该菌株能以TCA循环中间产物为唯一碳源进行生长 ,且在以葡萄糖、乙酸和TCA循环中间产物为复合碳源的平板上菌落数高于分别以葡萄糖和乙酸或TCA循环中间产物为唯一碳源时的菌落数。与其它TCA循环中间产物相比 ,草酰乙酸更能促进细胞的生长、提高丙酮酸产量和对葡萄糖的得率。草酰乙酸能够促进细胞生长 ,是因为T .glabrataCCTCCM2 0 2 0 19菌株能够利用乙酸作为乙酰辅酶A供体。在含有10 0g L葡萄糖和 6g L乙酸钠的培养基中再添加 10g L草酰乙酸进行分批发酵实验 ,可使菌体浓度从 11 8g L提高到 13 6g L ,增长幅度为 15 % ;丙酮酸对葡萄糖的得率 (0 6 6g g)以及生产强度 (1 19g·L- 1 ·h- 1 )分别高出 6 %和2 4 % ,使发酵结束时间提前 8～ 12h。

营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体,广泛应用于化工、制药及农用化学品工业。能够直接发酵生产丙酮酸的菌种主要有Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ[1],Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ[2],Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ[3],Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ[4],Ａｇａｒｉｃｕ?..

氧化磷酸化抑制剂对光滑球拟酵母糖酵解速度的影响

研究了不同浓度电子传递链抑制剂(鱼藤酮和抗霉素A) 和FOF1-ATPase抑制剂(寡霉素) 对光滑球拟酵母胞内ATP水平、葡萄糖消耗速度、糖酵解途径关键酶的影响. 在培养液中添加10 mg/L鱼藤酮和抗霉素A,相对于对照组,胞内ATP分别下降了43%和27.7%,使糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFK) 的活性分别提高340%和230%,从而导致葡萄糖消耗速度增加360%和240%,丙酮酸生成速度提高了17%和8.5%. 改变胞内ATP水平并不影响糖酵解途径其他关键酶HK、PK活性. 微量的寡霉素(0.05 mg/L) 可使胞内ATP含量下降64.3%,当培养液中寡霉素浓度达到0.4 mg/L时,细胞不能继续生长,葡萄糖消耗速度和丙酮酸的生成速度却随着寡霉素浓度(小于0.6 mg/L) 的增加而增加. 表明氧化磷酸化途径中,ATPase决定着ATP的生成. 降低胞内ATP含量能显著提高PFK活性(r2 = 0.9971) ,葡萄糖消耗速度(r2 = 0.9967) 以及丙酮酸生产速度(r2 = 0.965),葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶PFK活性(r2 = 0.9958) 和PK活性(r2 = 0.8706) 增加所导致的. 这一结果有利于揭示真核微生物细胞中氧化磷酸化与中心代谢途径(酵解) 的关系.

降低光滑球拟酵母电子传递链活性加速丙酮酸合成

光滑球拟酵母CCTCCM2 0 2 0 19经溴化乙锭诱变 ,挑选假阳性呼吸缺陷型菌株共 4 0株。对其中 7株丙酮酸产量提高的突变株进行发酵性底物 (葡萄糖 )和非发酵性底物 (甘油、乙酸 )的利用能力测试 ,鉴定得到 3株呼吸缺陷型突变株RD 16、RD 17和RD 18。相对于出发菌株 ,呼吸缺陷型突变株生长速率下降 ,最终菌体浓度降低 2 1%～2 9% ,胞内ATP含量下降 15 %～ 2 1% ,但单位细胞耗葡萄糖能力和单位细胞产丙酮酸能力分别提高了 2 0 7%～30 7%和 30 7%～ 5 5 5 %。进一步研究发现 ,呼吸缺陷型突变株线粒体复合体Ⅰ、Ⅰ +Ⅲ、Ⅱ +Ⅲ和Ⅳ的活性分别下降了 34%～ 4 1%、38 6 %～ 5 2 6 %、2 1%～ 2 5 %、15 0 %～ 6 30 % ,表明线粒体电子传递链氧化NADH的功能受到抑制。为使酵解产生的NADH正常氧化 ,在RD 18菌株的对数生长期流加 2 1mmol L外源电子受体乙醛。发现细胞合成丙酮酸能力提高 2 1 6 % ,且葡萄糖消耗速度明显加快 ,发酵周期缩短 14h。

过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度。【方法】将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata CCTCCM202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg蛋白的重组菌T.glabrata-PDnoxE。【结果】与出发菌株T.glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕。补加50g/L葡萄糖继续发酵20h,则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%。【结论】增加细胞内NAD+含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度。

丙酮酸发酵过程中光滑球拟酵母过程功能的强化

对不同葡萄糖浓度下光滑球拟酵母分批发酵生产丙酮酸的动力学模型分析发现,葡萄糖浓度是影响光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸过程功能的关键因素。在发酵初始阶段,低浓度葡萄糖可维持较高的菌体比生长速率;对数生长中前期,葡萄糖快速进料使菌体浓度接近最大值,并实现碳流从菌体生长转向丙酮酸积累;对数生长后期葡萄糖浓度控制在33.4 g/L以维持高丙酮酸对葡萄糖产率系数(0.71 g/g)。采用奇异控制的葡萄糖流加方式,在7 L发酵罐上控制不同发酵阶段葡萄糖浓度处于最佳水平以强化光滑球拟酵母过程功能,丙酮酸产量(83.1 g/L)、产率(0.621 g/g)、生产强度[1.00 g/(L·h)]与分批发酵对比,分别提高了21.3%、21.6%和29.9%。

葡萄糖对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

在 30L发酵罐中研究了初始葡萄糖质量浓度和补料方式对光滑球拟酵母WSH -IP30 3发酵生产丙酮酸的影响 .实验确定 1 1 6.4g/L左右是较为适宜的初始葡萄糖质量浓度 ,发酵 58h时丙酮酸质量浓度和产率分别为 58.0 g/L和 0 .51 6g/g .采用初始葡萄糖质量浓度为 53.4g/L ,发酵 2 4h分批补料至葡萄糖总质量浓度为 1 1 5g/L的培养方式 ,发酵 64h时丙酮酸质量浓度和产率分别为 60 .2 g/L和 0 .559g/g ;采用初始葡萄糖质量浓度为 62 .6g/L ,发酵 2 4h开始连续补料至葡萄糖总质量浓度为 1 1 5g/L的培养方式 ,发酵 72h时丙酮酸质量浓度和产率分别为 63.3g/L和 0 .586g/g ,与葡萄糖总质量浓度相似 ( 1 1 5g/L)的分批发酵相比 ,丙酮酸产量分别提高了 3.8%和 9.1 % .实验结果表明 :适宜的初始葡萄糖质量浓度能促进光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸 ;尽管葡萄糖补料培养可适度提高丙酮酸的产量及产率 ,但生产强度却有所下降 .

营养和环境条件对光滑球拟酵母葡萄糖代谢速度的影响

增加培养基中Mg^2＋浓度，使磷酸果糖激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶活性提高22．2％和23．4％，葡萄糖消耗速率从1．94g L^-h^-1提高到2．43g L^-1h^-1，提高了25％．较低kLa（200h^-1）导致胞内ATP处于较低的水平，变构激活糖酵解关键酶活性，与高kLa（450h^-1）比较，葡萄糖消耗速率（2．31g L^-1h^-1）提高了35％，低kLa虽能加快葡萄糖消耗，但不利于丙酮酸产量的提高．烟酸（NA）是细胞合成NAD^＋的前体，培养基中缺乏NA导致细胞生长微弱，葡萄糖消耗缓慢；NA质量浓度从4mg／L增加到8mg／L时，葡萄糖消耗速度（2．01g L^-1h^-1）和丙酮酸产量（46．4g/L）分别提高了48．4％和29％，高NA浓度有利于高葡萄糖消耗速度的提高，但降低了丙酮酸对葡萄糖的产率．一定浓度的（0～10mg／L）的外源电子受体乙醛提高了光滑球拟酵母中醇脱氢酶活性（提高8．6％），加速NAD^＋再生，降低NADH／NAD^＋比率，从而促进细胞生长和提高葡萄糖消耗速度．以上结果表明。

光滑球拟酵母转录因子Asg1p调控鲁棒性的生理机制

为了阐明缺失转录因子CgAsg1p对光滑球拟酵母鲁棒性的影响,通过同源重组的方法构建突变菌株Cgasg1△,比较基因缺失突变株在不同条件下的细胞生长、基因转录水平和对不同胁迫的抵御能力。结果表明:与野生型菌株wt相比,突变菌株Cgasg1△失去在pH 2.0下的生长能力,转录因子CgAsg1p在低p H条件下通过改变一系列应答基因的转录水平,影响压力调控、氧化还原过程、跨膜转运、DNA复制、重组和修复等生物过程,此外,突变菌株Cgasg1△也失去了对氧化胁迫和高渗胁迫的抵御能力。因此,CgAsg1p是光滑球拟酵母抵御多种胁迫的关键转录因子。

营养条件对光滑球拟酵母积累α-酮戊二酸的影响

以光滑拟球酵母为研究模型,研究α-酮戊二酸的浓度情况。通过单因素实验得到α-酮戊二酸积累最佳浓度的各单因素条件为:葡萄糖浓度140g/L,NH4Cl浓度5g/L。在碳源(30g/L葡萄糖初始浓度)匮乏条件下加入丙酮酸30g/L,在此条件下丙酮酸转化为α-酮戊二酸的转化率最高达53.7%。以30g/L丙酮酸为唯一碳源时在7L发酵罐中光滑拟球酵母可生成浓度为10.7g/Lα-酮戊二酸,外源丙酮酸的转化率可达66.9%。这一结果表明,T.glabrata具有将丙酮酸转化为α-KG的能力。

高渗胁迫对光滑球拟酵母转录组的影响

采用表达谱芯片技术,研究了光滑球拟酵母细胞在不同渗透压条件下(860、1 765、2 603m Os mol/kg和3 324 m Os mol/kg)的转录水平变化情况。结果表明,在高渗透压条件下,表达量大幅度提高的基因主要包括一些与细胞壁、细胞膜合成相关的基因,以及细胞膜上的信息素蛋白质基因。中心代谢途径(即糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸化途径)整体表现为显著上调,特别是参与ATP和NADH合成的相关基因。此外,对可能作为相容性溶质的氨基酸,如谷氨酸、脯氨酸、精氨酸的合成代谢途径的分析表明,脯氨酸和谷氨酸合成途径中的酶转录水平均有一定程度的提高,但是幅度不大;而精氨酸分解途径中的尿素羧化酶转录水平发生显著下调,其转录水平下降至1/100以下。

光滑球拟酵母新霉素抗性株加速葡萄糖代谢

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的生产强度,在能量代谢分析的基础上提出了降低ATP合成酶活性、但不影响NADH氧化的育种策略。通过亚硝基胍诱变,获得一株新霉素抗性突变株N07,该菌株F1ATPase活性降低65%、丙酮酸产量高于48gL且单位细胞消耗葡萄糖能力提高38%。添加双环己基碳二亚胺(DCCD)、叠氮钠(NaN3)、新霉素显著降低出发株F1ATPase活性但不影响突变株F1ATPase活性。突变菌株胞内ATP含量下降23.7%导致生长速率和最终菌体浓度(为出发菌株的76%)均低于出发菌株,但葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度分别提高34%和42.9%,发酵周期缩短12h。进一步研究发现,突变株糖酵解途径中关键酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和磷酸甘油醛激酶的活性提高了63.7%、28.8%和14.4%,电子传递链关键酶活性提高10%。结果表明降低真核微生物F1ATPase活性有效地提高了糖酵解关键酶活性而加速葡萄糖代谢。

高渗胁迫对光滑球拟酵母蛋白质组的影响

光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)在生产丙酮酸的过程中,发酵液渗透压不断提高,导致细胞生长缓慢,影响丙酮酸的持续积累。实验通过二维电泳和同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,比较不同渗透压条件下蛋白质组的差异。结果表明,在渗透压为1 765、2 603和3 324 mOsmol/kg时,相对于对照条件(860mOsmol/kg),分别有125、91和109个蛋白表达水平上调,94、89和78个蛋白表达水平下调,其中中心代谢和能量代谢途径的蛋白质表达量明显提高。此外,研究还发现,渗透压胁迫可诱导超氧化物歧化酶和富脯蛋白的表达量增加,前者可能和高渗环境下活性氧簇的积累有关,而后者可能与胞内脯氨酸的积累有关。该文为后续研究如何提高T.glabrata抵御高渗胁迫的能力提供理论依据。

光滑球拟酵母金属硫蛋白基因的亚克隆和表达研究

用BamHI和PstI双酶切质粒pMTIIa－91s，获得光滑球拟酵母金属硫蛋白基因（MTIIa）片段，将其亚克隆到M13载体，扩增并回收MTIIa基因片段，经Southern杂交验证插入片段正确后，分别将MTIIa基因片段插入到大肠杆菌表达载体pBV220和大肠杆菌一酵母菌穿梭载体YIp352中，转化大肠杆菌DH5a，使其对CUSO4的抗性提高0．7mol／L左右；转化酿酒酵母受体菌YS59，使YS59对CUSO4的抗性提高1．5mol／L左右。结果证明光滑球拟酵母MTIIa基因在大肠杆菌和酿酒酵母中都获得高效表达。

光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析

以光滑球拟酵母为出发菌株,利用生化和分子生物学实验研究微生物抵御有机溶剂胁迫的生理机制。首先,添加柠檬酸盐考察能量供给对细胞抵御乙偶姻胁迫的影响。与对照条件(0 mmol/L柠檬酸盐)相比,50 mmol/L柠檬酸盐可使细胞生物量在不同乙偶姻质量浓度(6、10、12和15 g/L)胁迫下分别提高了13.2%、14.2%、17.8%和25.2%。同时,通过表达线粒体融合分裂调控基因fzo1和dnm1,以细胞活力、胞内活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)为研究指标考察调控线粒体融合分裂对乙偶姻胁迫的影响。结果表明:与对照菌株相比,在不同乙偶姻质量浓度胁迫下(12和18 g/L),增强线粒体融合可抑制胞内ROS的产生,使其水平分别降低了9.3%和16.2%;却使胞内ATP水平分别提高了9.7%和36.1%,从而延缓乙偶姻胁迫对细胞活力的影响,使细胞生物量相应地提高了9.1%和29.7%。因此,通过添加柠檬酸或改善线粒体生理功能以提高胞内能量供给,可有效提高微生物细胞抵御乙偶姻等环境胁迫的能力。

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进α－酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20U/mg protein)的重组菌T.glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T.glabrata ACS2-1:(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-酮戊二酸浓度达到17.8g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸。

光滑球拟酵母适应进化改善丙酮酸生产

丙酮酸是重要的有机合成中间体,广泛应用于医药、化妆品、化学生产等工业中。发酵法生产丙酮酸是获得丙酮酸的主要方法之一,为了提高光滑拟球酵母菌的生长和发酵能力,缩短发酵周期,减少生产过程中能量消耗,改善丙酮酸生产性能,选取了一株产丙酮酸的光滑球拟酵母菌3672 CGMCC No0879进行高温适应进化,得到一株相对于出发菌株,能够在40℃生长良好,且葡萄糖代谢率快,丙酮酸产量稳定的耐高温菌株光滑球拟酵母TIB-G90 CGMCC No5434,在40℃条件下发酵24h时,丙酮酸积累量可达到28g/L左右,而出发菌株在30℃条件下需要发酵36h才能达到相同的丙酮酸积累量。

光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的补料过程优化

为了提高1株光滑球拟酵母(Candida glabrata)高产突变菌株的丙酮酸产量和底物转化率,对发酵过程进行了系统优化。首先,对诱变筛选获得的7株菌株进行发酵验证,确定最佳菌株为C.glabrata 4H2。对种子培养基重要成分及浓度进行优化,确定最佳氮源为大豆蛋白胨,质量浓度为10 g/L。突变菌株在30℃条件下摇瓶发酵52 h,产量达到(48.56±0.46)g/L,生产强度为0.93 g/(L·h),糖酸转化率为0.46 g/g,比优化前分别提高了25.0%、52.5%和43.8%。基于上述结果,在15 L发酵罐中进行发酵条件优化,确定了以初始葡萄糖质量浓度为80 g/L,当葡萄糖质量浓度剩余55 g/L时,恒速流加70 g/L葡萄糖的补料发酵工艺,最终丙酮酸的产量达到最高,为(86.63±0.29)g/L,较摇瓶水平提高了78.4%,生产强度为1.07 g/(L·h),糖酸转化率为0.78g/g。研究表明,发酵过程优化强化光滑球拟酵母生产丙酮酸是一种有效的方法,该研究为进一步提升工业水平丙酮酸发酵性能奠定了基础。

异源表达NADH选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及丙酮酸生产强度

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)葡萄糖代谢速率及丙酮酸生产强度。【方法】将源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的编码选择性氧化酶的AOX1基因过量表达于T.glabrata中,获得了一株线粒体内NADH氧化途径发生改变且胞内总NADH氧化酶活性提高1.8倍的重组菌株AOX。【结果】与出发菌株CON比较,细胞浓度以及发酵周期降低了20.3%和10.7%,而平均比葡萄糖消耗速率和丙酮酸合成速率分别提高了34.7%和54.1%。其原因在于NADH选择性氧化酶过量表达,导致胞内NADH/NAD+比率和ATP含量分别降低了74.7%和52.9%,而磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性分别提高了185.0%和28.1%。【结论】构建线粒体内非产能的NADH氧化途径,加速NADH氧化的同时降低ATP合成,能有效地提高酵母细胞糖酵解代谢速度及目标代谢产物的生产强度。