一种观察藻胆体移动的光漂白后荧光恢复技术

文章从样品制备、测定方法、数据分析方面就如何应用光漂白后的荧光恢复(FRAP)技术观测蓝藻藻胆体在类囊体膜上的移动进行介绍,得到的结果表明FRAP技术可以直接而有效地观测蓝藻藻胆体在类囊体膜上的移动情况。

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的 探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法 利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果 在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。

基于荧光漂白恢复技术检测乳脂肪球膜上生物分子的流动性

为了推动乳制品的精准评价,采用高分辨率激光共聚焦显微镜(CLSM)结合多荧光探针技术观察乳脂肪球的微观结构,并利用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)定量检测母乳、牛乳、羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的流动性。结果表明:3种乳的微观结构基本一致,均出现了新月区,证明了新月区是局部磷脂富集区;乳脂肪球中甘油三酯和水溶性蛋白质的动态分子比例较高,极性脂质和磷脂酰胆碱的动态分子比例较为接近,鞘磷脂的动态分子比例最差;牛乳中甘油三酯的流动性慢于母乳和羊乳,母乳中极性脂的流动性最慢。FRAP可以直观地表征乳脂肪球膜上生物分子的流动性,可为乳状液中膜界面的生化特性研究提供新的方法。

荧光光漂白恢复技术检测PC12细胞在细菌纤维素上的生长

目的通过荧光光漂白恢复技术观察PC12细胞在纳米细菌纤维素上的生长作用。方法制备纳米细菌纤维素膜并与PC12细胞共培养,通过FRAP技术利用激光共聚焦观察PC12细胞间缝隙连接的通讯功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道得到一定程度的恢复,在胞内荧光漂白后第4分钟时,实验组的平均荧光漂白恢复率为(22.3±0.39)%,与对照组的(21.8±0.85)%相比差异无统计学意义。结论 PC12细胞可在细菌纤维素膜上良好生长,能维持正常的细胞间通讯功能。

FRAP技术揭示PLZF-RARα融合蛋白在细胞核内的运动性依赖于其配基及转录活性

目的运用光漂白荧光恢复(FRAP)技术检测一系列带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的野生型及突变型的早幼粒细胞性白血病锌指-维甲酸受体α(PLZF-RARα)表达蛋白分子在细胞核内运动性。方法运用凝胶迁移实验(EMSA)检测带有GFP标签的野生型及突变型PLZF-RARα融合蛋白结合维甲酸反应元件(RARE)的能力;运用FRAP以及共聚焦荧光显微镜分析一系列GFP-PLZF-RARα及其突变体表达蛋白在细胞核内的运动性;运用转录抑制剂放线菌素D(Act D)和/或全反式维甲酸(ATRA)处理GFP-RARα和GFPPLZF-RARα表达细胞,运用FRAP观察PLZF-RARα和野生型RARα在细胞核内的运动性变化情况。结果位于PLZF结构区的POZ以及锌指结构域不仅是引起PLZF-RARα核内运动性降低的主要原因,同时也是引起配体诱导的核内运动性减慢的关键因素。Act D能够显著地抑制PLZF-RARα和RARα蛋白分子在细胞核内的运动性;分化诱导剂ATRA处理可逆转Act D引起的RARα核内运动性降低效应,但经Act D处理的PLZF-RARα分子无此效应。结论运用FRAP技术发现PLZF-RARα融合蛋白在细胞核内的运动性减慢可能依赖于配体的存在及其转录活性。

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(hum an m esenchym al stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junc-tional intercellu lar commun ication,G JIC)功能。方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescencered istribution after photob leach ing,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的G JIC功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26±0.76)%。结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式。

近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响

目的:观察近紫外线对兔晶状体上皮细胞通讯功能的影响.方法:对兔晶状体前囊膜行组织块细胞培养,将传代2～3代兔晶状体上皮细胞在12孔板中培养24 h后,分为正常对照组和近紫外线照射组(同一近紫外线光源下一固定位置50 cm,测得该点的功率为0.2 mW/cm2,给于同一强度,5,10,15 min不同时间的近紫外线照射,采用荧光光漂白恢复技术(FRAP),通过激光共聚焦显微镜检测各组兔晶状体上皮细胞的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能变化情况.结果:FRAP测定正常对照组和近紫外线照射组细胞GJIC功能,正常对照组细胞平均荧光恢复率为(58.337±5.620)%,随着照射时间的延长,近紫外线照射组细胞平均荧光恢复率逐渐下降,分别为(34.205±3.652)%,(18.809±3.017)%,(7.029±2.917)%,与正常对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论:近紫外线照射能降低兔晶状体上皮细胞GJIC功能,随着照射时间的增加,其功能下降越明显.

人脐动脉内皮细胞和平滑肌细胞体外培养鉴定及缝隙连接通讯功能测定

目的:应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs),应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法:人脐动脉ECs、SMCs分离培养,Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs,应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能,记录实时成像结果,应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果:第一组ECs和SMCs单独培养,选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接,SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69;ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11;第二组ECs和SMCs混合培养,选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞,SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28,ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论:FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度,参照FRAP恢复曲线,M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标,通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC,且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。

5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化

目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT1A-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT1A-EGFP荧光蛋白在细胞膜上转运的情况。结果克隆所获得的小鼠5-HT1A基因是准确的。5-HT1A-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKE293细胞膜上。通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运。结论建立了稳定表达5-HT1A-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT1A受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化。

光学在生物分子研究中的应用

综述了如荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)、荧光相关光谱(FCS)、表面质膜共振(SPR)等光学方法在生物分子研究中的应用。

微米级核壳量子点团聚体在生物膜中的扩散与溶解及其毒性

包括量子点在内的人工纳米颗粒是近年来突出的环境污染物,为确定其在生物膜中的扩散过程和特征,应用TIRF(全内反射荧光)、FRAP(荧光漂白后恢复)等技术,研究了CdTe/CdS/ZnS核壳式量子的微米级的团聚体在细菌Comamonas testoteroni生物膜表面的吸附动力学、生物膜内部的扩散及其在生物膜中的溶解和毒性.结果表明:通过TIRF技术观察到生物膜可快速吸附>1μm的CdTe/CdS/ZnS核壳式量子点团聚体,而且通过CLSM(激光扫描共聚焦荧光显微镜)进行深度扫描发现,量子点团聚体吸附到生物膜表面后可以进一步扩散到生物膜深层,在25 min内可穿透45μm的生物膜,并在生物膜中随深度呈线性分布特征.FRAP分析表明,量子点团聚体被生物膜固定后还具有较强的移动性,漂白区的荧光强度在5 min可恢复30%.量子点团聚体在生物膜中会溶解产生Cd^(2+)、Zn^(2+)等重金属离子,从而对生物膜产生毒性并杀死细菌.研究显示,虽然纳米颗粒进入环境中会形成微米级的团聚体,但依然可以进入生物膜,对水生微生物生态系统产生危害.TIRF、CLSM和FRAP技术是研究纳米颗粒物在生物膜表面吸附和内部扩散动力学的有效工具.

逼尿肌不稳定缝隙连接介导细胞间通讯的研究

目的 研究逼尿肌不稳定 (DI)缝隙连接介导的细胞间通讯 (GJIC)功能 ,探讨DI发病机理以及阻断兴奋传递作为治疗手段的可行性。 方法 采用荧光光漂白恢复技术 (FRAP)检测BOO大鼠模型培养膀胱逼尿肌细胞GJIC功能 ,以荧光恢复率作为比较。 结果 在漂白后第 4min时 ,DI组平均荧光恢复率为 (35 .791± 0 .836 ) % ,正常对照组为 (8.6 4 5± 0 .6 73) % ,DI组显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,差异有显著性意义。 结论 细胞间兴奋传递增强是DI发生的重要原因之一。

槲皮素对UVB辐射HaCaT细胞膜流动性的影响

目的:基于过量UVB照射角质形成细胞HaCaT所致细胞膜流动性变化,探讨植物单体槲皮素(Qu)对细胞光应激的保护机制。方法:体外培养HaCaT细胞,分别加入25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的Qu,孵育后更换培养基,以30mJ/cm2UVB剂量进行照射,Dio荧光探针标记细胞膜,激光共聚焦显微镜下观察其膜流动性的变化。结果:紫外照射组细胞膜流动性扩散系数D及荧光恢复率R最低;50μg/ml药物组荧光恢复率明显优于25μg/mL药物组,100μg/mL药物组略优于50μg/mL药物组,与正常组无显著性差异。结论:一定浓度范围内Qu对UVB所致的细胞膜的流动性损伤具有明显的保护作用(P<0.05),并与剂量成正相关性。