TNF-α通过调控肺成纤维细胞旁分泌光蛋白聚糖诱导小气道上皮细胞向间充质细胞转化

目的探索炎症介质肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导肺成纤维细胞旁分泌光蛋白聚糖(lumican)对小气道上皮细胞间充质转化的影响与调控机制。方法体外培养人原代肺成纤维细胞(human primary lung fibroblasts;HLF)与人原代小气道上皮细胞(human primary small airway epithelial cells;HSAE),通过转录组测序与RT-qPCR检测lumican在两种细胞内的表达情况。利用lumican siRNA靶向沉默HLF lumican表达后,将HLF与HSAE进行共培养,检测TNF-α刺激下HSAE中上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transi-tion;EMT)相关指标的变化。采用ERK磷酸化特异性抑制剂预处理HSAE后,检测lumican刺激下ERK/slug通路的活性变化。结果RNA测序与RT-qPCR结果显示lumican在HSAE中几乎不表达,而在HLF中表达量较高。TNF-α可以显著增加HLF中lumican的合成和分泌。TNF-α作用于HLF与HSAE共培养体系后可诱导HSAE中α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin;α-SMA)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅢ,alpha 1 chain;COL3A1)的表达,下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。Lumican siRNA预处理HLF后可以抑制上述改变。利用重组蛋白lumican处理HSAE后,发现HSAE中ERK磷酸化和Slug蛋白水平增加,α-SMA表达上调的同时E-cadherin表达下调,而ERK磷酸化抑制剂预处理可以显著抑制该变化。结论炎症介质TNF-α可能通过促进肺成纤维细胞旁分泌lumican,作用于小气道上皮细胞,激活ERK/Slug信号通路,引起小气道上皮细胞向间充质细胞转化,进而促进炎性损伤后的纤维化进程。

氟化物对大鼠牙胚中光蛋白聚糖影响的免疫组化观察

目的:观察氟化物对牙胚分泌期成釉细胞中光蛋白聚糖(lumican)表达情况的影响。方法:取妊娠10 d孕鼠,随机分为对照组、实验1组和实验2组,每组3只鼠,饮水中给氟浓度分别为0(去离子水)、50、150 mg/L,妊娠21 d时取材(部位为包含胎鼠下颌第一磨牙牙胚的下颌骨段),固定,包埋,每组随机选择10个蜡块做连续5μm切片,分别做HE染色,以及lumican的免疫组化SABC法染色,镜下观察,图像分析,所得数据用SPSS 16.0软件进行统计分析。结果:氟化物作用下,妊娠21 d时,胎鼠牙胚成釉细胞中lumican的表达水平较对照组均有所减弱,试验组2(高氟浓度)尤为明显。结论:氟化物可使牙胚分泌期成釉细胞中lumican的表达降低,高浓度时作用较强。

核心蛋白聚糖和光蛋白聚糖在体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达

目的:研究体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中两种小分子蛋白聚糖(核心蛋白聚糖和光蛋白聚糖)的表达水平,探讨这两种蛋白聚糖与瘢痕疙瘩发生机制的关系。方法:采用实时PCR(Real-timePCR)和WesternBlot方法,研究体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中核心蛋白聚糖和光蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平,并进行比较分析。结果:不同患者来源的瘢痕疙瘩成纤维细胞中核心蛋白聚糖的mRNA表达水平差异较大,最高表达水平是最低表达水平的5.6倍。瘢痕疙瘩和正常皮肤的培养成纤维细胞中,核心蛋白聚糖和光蛋白聚糖在基因和蛋白表达水平上无显著性差异。结论:核心蛋白聚糖和光蛋白聚糖在体外培养的单层瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中的表达无特异性改变,它们在瘢痕疙瘩形成过程中所起的作用尚有待进一步研究。

光照强度对近视豚鼠的眼生物学参数、视网膜结构及巩膜组织lumican和MMP-2表达水平的影响

目的探讨光照强度对光学离焦性近视豚鼠的眼生物学参数、视网膜结构及巩膜组织光蛋白聚糖(lumican)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平的影响。方法选择健康3周龄豚鼠80只,雌雄不限。采用凹透镜诱导方法构建右眼光学离焦性低中度近视豚鼠模型,从造模成功的74只豚鼠中随机选取60只分为A组、B组、C组和D组,每组15只。A组每日置于室外充足阳光下3 h,平均光照度60000 lux;B组每日置于室外阴凉处3 h,平均光照度10000 lux;C组每日置于室内北窗处3 h,平均光照度2000 lux;D组每日室内正常饲养,平均光照度300 lux。其余时间统一室内饲养,平均光照度300 lux,正常摄食饮水,持续光照处理6个月。比较各组豚鼠眼生物学参数(眼轴长度、屈光度),观察视网膜病理和超微结构,并检测巩膜组织lumican和MMP-2表达水平。结果与光照前比较,光照1个月、3个月及6个月时各组屈光度有不同程度增加;A组光照3个月、6个月,B组、C组和D组光照1个月、3个月及6个月时眼轴长度有不同程度增长,差异有统计学意义(P<0.05)。光照1个月时,A组和B组屈光度、眼轴长度低于D组;光照3个月、6个月时,A组屈光度、眼轴长度低于B组、C组和D组,B组屈光度、眼轴长度低于D组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组凋亡细胞数量少于C组、D组,且A组凋亡细胞数量少于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组视网膜结构损伤程度较C组、D组轻,且A组损伤程度较B组轻。光照6个月后,与C组、D组比较,A组和B组的lumican表达水平较高,MMP-2表达水平较低,且A组lumican表达水平高于B组,MMP-2表达水平低于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论室外高强度光照能促使豚鼠巩膜组织中lumican表达上调,MMP-2表达下调,稳固巩膜结构,具有减缓眼轴增长和近视进展的作用。

阿托品对大鼠巩膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 探讨不同浓度阿托品对大鼠巩膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 取出生24 h的健康雄性SD大鼠眼巩膜组织(均为右眼)进行原代培养。取细胞进行分组:对照组(正常巩膜成纤维细胞),0.1 g·L^(-1)、1.0 g·L^(-1)及5.0 g·L^(-1)阿托品处理组(正常巩膜成纤维细胞分别加入三种不同浓度阿托品溶液),每组5只大鼠原代培养细胞。加药后24 h, CCK-8法检测各组巩膜成纤维细胞活力,流式细胞仪检测各组巩膜成纤维细胞凋亡率,Western blot法检测各组巩膜成纤维细胞光蛋白聚糖、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-14和MMP抑制剂(TIMP)-2蛋白表达情况。结果 CCK-8实验结果显示:与对照组相比,0.1 g·L^(-1)、1.0 g·L^(-1)及5.0 g·L^(-1)阿托品处理组细胞活力均增高,其中以1.0 g·L^(-1)阿托品处理组增高最显著,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果表明:阿托品处理组各组的巩膜成纤维细胞凋亡率与对照组相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与对照组相比,阿托品处理组巩膜成纤维细胞中光蛋白聚糖、TIMP-2蛋白相对表达量均升高,其中以5.0 g·L^(-1)阿托品处理组上升最明显(均为P<0.05);与对照组相比,阿托品处理组巩膜成纤维细胞中MMP-2、MMP-14蛋白相对表达量均降低,其中以5.0 g·L^(-1)阿托品处理组下降最明显(均为P<0.05)。结论 阿托品处理能增强体外培养大鼠巩膜成纤维细胞活力,这种效应的产生可能与光蛋白聚糖、MMPs、TIMPs等细胞因子有关。

Lumican调控FAK信号通路对胃癌AGS细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:探讨光蛋白聚糖(lumican)调控FAK信号通路对胃癌AGS细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测胃癌组织与正常胃组织中lumican的表达。通过转染小干扰RNA(siRNA)或过表达(OE)质粒下调或上调胃癌AGS细胞中lumican的表达,EDU检测细胞增殖,Transwell检测细胞侵袭、迁移,Western blotting检测lumican、粘着斑激酶(FAK)、磷酸化(p-)FAK蛋白表达量。结果:胃癌组织中lumican蛋白表达量明显高于正常胃组织(P<0.05)。与siRNA阴性对照(NC)组相比,siRNA组AGS细胞增殖、侵袭及迁移能力显著降低(P<0.05),而OE组AGS细胞增殖、侵袭及迁移能力明显增强(P<0.05);siRNA组FAK和p-FAK蛋白表达量下降(P<0.05),而OE组FAK和p-FAK相关蛋白表达量升高(P<0.05)。结论:Lumican在胃癌组织中的表达增强,其可能通过激活FAK/p-FAK通路促进胃癌AGS细胞侵袭、迁移及增殖。

人突变Lumican转基因小鼠角膜组织中小分子亮氨酸蛋白聚糖成员表达改变的研究

目的探讨人突变Lumican转基因小鼠角膜组织中小分子亮氨酸蛋白聚糖(SLRP)成员mRNA水平表达变化。方法实验研究。选取10只(雌雄各5只)人突变Lumican转基因小鼠作为实验组,选取10只(雌雄各5只)同周龄野生型C57BL/6J小鼠作为对照组。转基因小鼠Lumican基因突变位点为cDNA569T>C,使第199位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸(L99P)。8周龄时脱颈法处死入组小鼠,摘取双侧眼球后获得双眼角膜组织,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-Q-PCR)技术分别检测两组小鼠角膜组织中Lumican、Decorin、Biglycan、Keratocan、Fibromodulin基因在mRNA水平的表达。采用两独立样本均数t检验对两组小鼠基因表达差异进行统计学分析,差异以倍数变化法表示。结果实验组转基因小鼠角膜组织中Lumican基因mRNA表达升高,是对照组野生型小鼠的1.497倍,差异具有统计学意义(t=4.34,P<0.05)。实验组小鼠角膜组织中Keratocan基因mRNA表达降低,是对照组的0.323倍,差异具有统计学意义(t=-95.94,P<0.05)。实验组中Decorin基因mRNA表达降低,是对照组的0.648倍,差异均具有统计学意义(t=-9.98,P<0.05)。实验组较对照组Biglycan基因mRNA表达降低,是对照组的0.522倍(t=-7.74,P<0.05),Fibromodulin基因mRNA表达升高,是对照组的1.193倍,差异无统计学意义(t=1.66,P>0.05)。结论人突变Lumican转基因小鼠与野生小鼠相比,角膜组织中SLRP成员mRNA水平表达发生改变,提示Lumican基因突变(cDNA569T>C)可能导致该基因结构破坏,调控角膜组织中其他SLRP成员基因表达的功能受损。此外,该基因位点的突变导致Lumican核心蛋白中第199位氨基酸由亮氨酸突变为脯氨酸(L199P),提示Lumican基因突变可能阻碍了Lumican与胶原蛋白分子结合,进而影响了SLRP成员的表达。

近视眼相关Lumican基因突变对人巩膜成纤维细胞中bFGF和TGF-β2的影响

目的探讨腺病毒介导的Lumican基因突变(c.596T>C)对人巩膜成纤维细胞(HSF)中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β2(TGF-β2)的影响,明确该突变在近视眼发生和发展中的作用。方法实验研究。应用组织块培养法分离培养HSF。取3~5代细胞转导病毒,转导突变型Lumican(c.596T>C)腺病毒的HSF为突变组、转导野生型Lumican腺病毒的HSF为野生组、转导缺陷型腺病毒的HSF为阴性对照组,未转导病毒的HSF为空白对照组。每组重复3次。采用实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)检测各组细胞Lumican、bFGF、TGF-β2基因的表达水平。对比相同时间各组间的基因相对表达差异,差异以倍数变化法表示,采用单因素方差分析联合LSD-t检验进行统计学分析。结果突变组和野生组的Lumican基因表达量分别为空白对照组的103.146和398.646倍,高于阴性对照组,差异有统计学意义(t=-16.641,-21.729;P<0.05),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(t=1.689,P>0.05)。突变组的bFGF基因表达量为空白对照组的2.812倍,TGF-β2基因表达量为空白对照组的2.346倍,均高于野生组及阴性对照组,差异有统计学意义(t=-3.921,-4.851;P<0.05),野生组、阴性对照组及空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Lumican基因突变(c.596T>C)使HSF中bFGF和TGF-β2的表达增加,提示Lumican基因突变(c.596T>C)可能通过调控bFGF和TGF-β2的表达改变巩膜组织的细胞外基质代谢,从而参与近视眼发生和发展过程中的巩膜重塑。