活体心肌细胞NAD(P)H荧光的光谱分辨的荧光寿命光谱研究

目的 研究实验动物心肌线粒体氧化还原状态,监测缺血时线粒体功能改变的早期信号.方法 线粒体呼吸链主要电子供应者烟酰胺腺嘌呤(磷酸)二核苷酸,或NAD(P)H荧光为无创荧光标记,用光谱分辨的时间相关单光子计数(TCSPC)检测紫外光(UV)激发的心肌自发荧光(AF)光谱和荧光寿命.结果 需用至少3个荧光寿命池0.4～0.7 ns,1.2～1.9 ns和8.0～13.0 ns描述心肌AF.相关衰减光谱(DAS)显示4个NAD(P)H荧光固有光谱,分别为峰值470 nm的短荧光寿命池,及450 nm,470 nm和490 nm的中间和长荧光寿命池.酮体增加线粒体NADH产量,提高AF强度,但不改变荧光寿命.线粒体呼吸阻断剂Rotenone,显著增加AF强度和缩短平均荧光寿命.氧化磷酸化解偶联剂Dinitrophenol (DNP),显著降低AF强度,在520 nm处增宽荧光光谱并显著延长平均荧光寿命.这些结果和NADH荧光动力学离体实验(in vitro)及模拟缺血状态实验有可比性.结论 研究可解释NADH构象改变,以及从NADH到异戎酸脱氢酶(LipDH)结合的黄素蛋白间能量转移的荧光动力学变化.光谱分辨的荧光寿命显微技术提供了在细胞水平上研究心肌能量代谢或线粒体功能障碍的新工具.

光谱分辨的NAD(P)H荧光寿命光谱学对心肌氧化代谢的评估

应用光谱分辨的NAD(P)H荧光寿命光谱学研究心肌细胞线粒体氧化代谢状态,监测病理情况下线粒体功能改变的早期信号。研究将NAD(P)H作为无创荧光探针,用光谱分辨的时间相关单光子计数记录375nm紫外光激发的心肌自发荧光(AF)光谱和寿命,测试影响NADH生产或线粒体呼吸时AF动态衰减。结果显示:在420～560nm光谱区域,需用至少3个荧光寿命池0.4～0.7ns、1.2～1.9ns和8.0～13.0ns描述细胞AF。酮体增加NADH水平,提高AF强度,但不改变荧光寿命。线粒体呼吸阻断剂Rotenone,显著增加AF强度,缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂(DNP),显著降低AF强度,在520nm处增宽荧光光谱,延长平均荧光寿命。这些结果和NADH荧光动力学离体实验(invitro)有可比性。研究证实光谱分辨的荧光寿命技术测定心肌NAD(P)H荧光有很好的重复性,增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍在细胞水平上的知识,为临床诊断和治疗线粒体功能障碍开拓了新视野。

心肌细胞NAD(P)H荧光成分分析法监测心脏移植排斥反应

目的为早期诊断和有效预防心脏移植排斥反应,研究在细胞水平用心肌NAD(P)H荧光成分分析监测排斥反应的可行性。方法用NAD(P)H荧光标记监测线粒体功能,从14例儿童心脏移植患者心内膜活检组织中分离活体心肌细胞和大鼠(n=5,13～14周龄)心肌细胞,光谱分辨的时间相关单光子计数(TCSPC)记录375nm紫外激光激发的心肌自发荧光(AF)光谱和荧光寿命。将鼠心肌细胞分为4组,无缺氧对照组,无缺氧鱼藤酮组,缺血对照组和缺血鱼藤酮组;对比无排斥反应(R0)人心肌细胞,无缺氧鼠细胞和缺血鼠细胞间,R0人心肌细胞和轻度排斥反应(R1)间的AF动力学变化。结果成功分离并测定了人心肌细胞AF光谱,在420～560nm光谱区域,至少存在0.5～0.7ns,1.9～2.4ns和9.0～15.0ns3个AF寿命池。与无缺氧对照组比较,缺血对照组鼠心肌细胞荧光强度明显增强(P<0.05);无缺氧鱼藤酮组和缺血鱼藤酮组心肌AF强度均显著增强,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。R0组人心肌细胞AF强度显著弱于无缺氧对照组鼠心肌细胞(P<0.05);人心肌AF强度与排斥反应相关,R1的荧光强度显著增强(P<0.05),但光谱形态无改变,与缺血对照组鼠心肌细胞光谱改变一致。结论光谱分辨的荧光光谱结合荧光寿命分析是监测心肌线粒体氧化代谢的敏感方法,有良好的重复性。人心肌AF表现出较高的代谢活性,排斥反应时活性降低。该技术结合多光子共聚焦显微镜,可直接在体评估线粒体功能,是监测早期排斥反应的新方法。

应用心肌自发荧光评估存活心肌线粒体氧化代谢状态

目的：应用心肌自发荧光（AF）研究心肌线粒体氧化代谢状态，监测线粒体功能改变的早期信号。方法：烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸ENAD（P）HI作为荧光探针，用光谱分辨的时间相关单光子计数（TCSPC）记录375nm紫外激光激发的心肌AF光谱和荧光寿命，测试影响线粒体呼吸时AF动态衰减。结果：在420～560nm光谱区域，至少需用3个荧光寿命池0．4～0．7ns，1．2～1．9ns和8．0～13．0ns描述细胞AF。线粒体呼吸阻断剂鱼藤酮可显著增加AF强度，缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂二硝基酚可显著降低AF强度，在520nm处增宽荧光光谱，延长平均荧光寿命。这些结果和NADH荧光动力学离体实验（invitro）有可比性。结论：光谱分辨的荧光寿命技术测定心肌NAD（P）H荧光有很好的重复性，在细胞水平上增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍的知识，为临床诊断和治疗线粒体功能障碍开拓了新视野。