重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制,为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH 1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定;CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间;Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响;ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示:成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体,经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,纯度达90%以上,浓度为0.2 mg·mL^(-1)。与空白对照组相比,采用50μg·mL^(-1)的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高(P<0.01),6 h时,TLR4表达量显著降低(P<0.05),TLR2、MyD88表达量无显著变化;p-JNK在1 h时的表达量无显著变化,3、6 h时极显著降低(P<0.01);p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高(P<0.05,P<0.01);p-p38在1 h时的表达水平极显著降低(P<0.01),3、6 h时极显著升高(P<0.01);p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高(P<0.01)。IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势(P<0.05,P<0.01);IL-6在作用1、3 h后极显著上升(P<0.01),6 h后显著降低(P<0.05);IL-12在作用1 h后极显著上升(P<0.01),3、6 h后极显著降低(P<0.01)。本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应,rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一。

深部克柔念珠菌感染豚鼠模型的建立及致病性初步研究

目的建立深部克柔念珠菌感染的豚鼠模型,并对其进行致病性研究。方法采用皮下注射曲安奈德和腹腔注射环磷酰胺诱导豚鼠进入免疫抑制状态后,静脉注射克柔念珠菌悬液,使豚鼠发生深部克柔念珠菌感染;与免疫正常组(对照组)豚鼠比较,观察两组死亡情况和脏器的组织载菌量,并进行统计学分析。结果免疫抑制组(实验组)豚鼠的死亡从感染后1d开始,3～4d达到高峰,至第6天止,其死亡率是正常组的10倍(P<0.01);各脏器的组织载菌量明显高于对照组(P<0.05);在检查的4种脏器中,最为易感的是肾脏,最不易感的是肝脏,各脏器间易感的差异有显著性(P<0.01)。结论本实验能有效诱导豚鼠的免疫抑制状态,明显增加豚鼠体内发生深部克柔念珠菌感染的概率;豚鼠的死亡率和组织载菌量是客观反映豚鼠体内真菌感染情况的敏感观察指标。用上述方法成功建立的深部克柔念珠菌感染豚鼠模型可用于后续抗真菌药体内抗真菌活性的研究。

伏立康唑、氟康唑和两性霉素B体内抗克柔念珠菌活性的比较研究

目的比较伏立康唑、氟康唑和两性霉素B在体内对克柔念珠菌的抗真菌活性。方法在克柔念珠菌深部感染的免疫抑制豚鼠模型上,对感染豚鼠分组给予口服伏立康唑10mg/kg,2次/d;伏立康唑5mg/kg,2次/d;氟康唑20mg/kg,2次/d;两性霉素B1mg/kg隔日1次腹腔注射;安慰剂对照组给予生理盐水0.5ml,2次/d口服。均连续7天。观察比较各组的死亡率及脏器组织载菌量。结果安慰剂对照组豚鼠的所有受检脏器都受到了严重的感染。5个处理组中,伏立康唑10mg组的组织载菌量与死亡率(0%)均最低;与对照组相比,该方案使念珠菌在肺、肝、肾、脑四种脏器中的组织载菌量都减少了约99%(P<0.01)。伏立康唑5mg组的组织载菌量和豚鼠死亡率均与安慰剂对照组相近,无显著性差异。氟康唑组的组织载菌量与对照组相近,其死亡率(40%)仅略低于对照组,两组间无显著性差异(P>0.05)。伏立康唑10mg组与两性霉素B组相比,在组织载菌量和死亡率方面均较为接近,较之安慰剂对照组均有显著差异(P<0.01)。结论伏立康唑在免疫抑制豚鼠体内能有效地抑制感染脏器中克柔念珠菌的生长,其作用明显优于氟康唑,与两性霉素B作用相近,但两性霉素B常有严重的不良反应。伏立康唑在体内可能以剂量依赖的形式显示其抗真菌活性。

抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗作用

为研究抗菌肽CGA-N46对皮肤感染克柔念珠菌小鼠的治疗效果,用克柔念珠菌感染免疫抑制小鼠制备感染模型,采取皮肤病变观察、皮下脓疱液和痂皮分离真菌,确定建模是否成功。对克柔念珠菌感染小鼠模型分别涂抹4 mg/mL和8 mg/mL CGA-N46进行治疗,以成活率、有效率和组织病理变化判断CGA-N46治疗效果。结果表明,以2×108 CFU/mL克柔念珠菌菌悬液感染表皮可建立感染模型;4 mg/mL和8mg/mL CGA-N46均能提高克柔念珠菌感染小鼠成活率,对克柔念珠菌皮肤感染有缓解作用,其中8mg/mL CGA-N46治疗效果更好。结果证实,CGA-N46对克柔念珠菌临床感染有治疗效果,具有开发成新型抗真菌药物的潜力。

克柔念珠菌对抗真菌药物耐药机制的研究进展

近年来,克柔念珠菌感染明显增加,对抗真菌药物尤其是唑类药物的耐药现象越来越严重,深入研究其耐药机制已引起高度关注。克柔念珠菌耐药机制可能与以下因素有关:唑类药物作用靶酶结构的改变、真菌细胞膜上外排泵过度表达、真菌细胞内药物蓄积减少等。克柔念珠菌对唑类的耐药可能是多种耐药机制共同作用的结果。

克柔念珠菌耐药机制的研究

由于广泛应用抗生素和不当使用非处方抗真菌药物,致病念珠菌感染在近年明显增多。念珠菌可以引起人体浅部和全身性感染,随着抗真菌药的广泛应用,真菌耐药性亦日趋严重。本文探讨克柔念珠菌耐药性产生的机制,为临床指导合理使用抗真菌药物提供理论依据。

克柔念珠菌的生物学、生态学及其致病性研究

目前,克柔念珠菌(Candida krusei)因能引起多种感染如真菌血症,眼内炎和心内膜炎,且多发生于住院的免疫力低下的患者而受到广泛重视。实验室研究显示克柔念珠菌比白念珠菌(C.albicans)毒力弱,其致病力与其强大的凭借细胞表面疏水性附着于非生物表面而繁殖的特性有关。此外,克柔念珠菌与其他医学上重要的念珠菌在结构、代谢特点上均有显著不同,并在对宿主的防御中表现出与众不同的行为模式,因此有必要对其进行重新认识。

克柔念珠菌感染的临床表现及治疗进展

近年 ,由于人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染的增加、器官移植和白血病患者的增多、唑类药物如氟康唑 (flu conazole)的预防性用药 ,导致了耐咪唑类药物的克柔念珠菌 (Candidakrusei)感染的增多。实验室研究显示克柔念珠菌在结构、致病性等方面均与白念珠菌有显著不同。其毒力比白念珠菌 (C .albicans)弱 ,但对非生物表面有强大的粘附力。其感染最常见的临床表现就是在免疫力低下的病人中发生的播散性真菌血症、眼内炎、关节炎和心内膜炎等。由于克柔念珠菌对氟康唑天然耐药 ,故目前仍在研究新的有效药物及联合用药方法。

系统性红斑狼疮合并中枢神经系统克柔念珠菌感染一例

感染是导致系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SIE）患者死亡的主要原因之一[1],感染的部位多为肺部、皮肤和泌尿道,而SIE合并中枢神经系统（central nervous system,CNS）感染少见[2]。现报道一例SLE合并CNS克柔念珠菌感染病例。

他克莫司和伊曲康唑联合使用体外抗克柔念珠菌作用的研究

目的单独应用抗真菌剂伊曲康唑和钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司,以及上述两种药物联合使用后,评估体外实验对克柔念珠菌生长的影响情况。是否联合用药比单独应用抗真菌剂更有效抑制克柔念珠菌的生长。方法根据美国临床及实验室标准协会指南的方法,将12株克柔念珠菌通过微量稀释法分为空白对照组、伊曲康唑组、他克莫司组以及联合用药组,然后将12株克柔念珠菌孵育24 h后,观察其生长情况。结果与单独使用伊曲康唑药物相比,联合用药作用下伊曲康唑最低抑菌浓度远小于单独使用伊曲康唑,其最高倍数达32倍,最小倍数达4倍;同样,他克莫司单独使用较联合伊曲康唑使用,最高倍数达32倍,最低倍数达2倍。结论 12株克柔念珠菌在伊曲康唑和他克莫司联合使用下,体外实验表现出强大的协同作用。

克柔念珠菌对抗真菌药物耐药的机制和新药开发研究进展

近年来,随着HIV感染的增加、广泛使用免疫抑制剂治疗、长期使用广谱抗生素以及侵入性的临床检查如实体器官或骨髓移植,使得非白色念珠菌已超过白色念珠菌,非白色念珠菌如光滑念珠菌、克柔念珠菌等所致的侵袭性真菌的发病率和病死率呈现上升的趋势。伴随着而来的是念珠菌的耐药现状也愈演愈烈,因此导致患者治疗的失败已成为临床的重要挑战。

培养条件对克柔念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果的影响分析

目的探究不同的培养时间、培养温度、培养基种类及培养气体环境对克柔念珠菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定结果的影响。方法收集中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)2012-2013年中17所医院克柔念珠菌25株,每株菌平行接种在沙堡弱氯霉素琼脂平板(SDA-C)、血琼脂平板等6种培养基,28℃和35℃2种孵育温度,空气和5%CO22种气体环境中孵育,以真菌rDNA ITS测序为金标准,孵育24 h和48 h后,使用Vitek MALDI-TOF质谱仪(简称Vitek MS)和Bruker Autoflex Speed型MALDI-TOF质谱仪(简称Bruker MS)分别进行菌种鉴定,并对其鉴定正确率进行分析。结果克柔念珠菌孵育24 h和48 h时Vitek MS鉴定正确率均为100%,Bruker MS鉴定正确率分别是98.86%和87.43%。28℃SDA-C上生长的克柔念珠菌种水平鉴定准确率较35℃生长的菌株高。比较各种培养基,孵育48 h时SDA-C上生长的克柔念珠菌Bruker MS鉴定正确率(100%)最高。结论克柔念珠菌接种在SDA-C上,28℃空气培养24 h质谱鉴定效果最佳。常规细菌培养基上生长的克柔念珠菌,Bruker MS鉴定分值≥1.700即可认为菌种鉴定可靠。

米卡芬净治疗光滑念珠菌和克柔念珠菌致念珠菌血症或侵袭性念珠菌病的转归

念珠菌属是医院获得性血流感染的常见病原菌之一,目前光滑念珠菌和克柔念珠菌约占念珠菌血症或侵袭性念珠菌病病原菌的25%。多项临床试验证实米卡芬净治疗念珠菌血症有效,但单个试验有一定局限性.光滑念珠菌和克柔念珠菌例数较少,本研究对2例评估米卡芬净治疗念珠菌血症及侵袭性念珠菌病的随机对照试验进行分析,

克柔念珠菌的耐药机制及抗真菌对策研究进展

由于临床上抗真菌药物的广泛使用,致使真菌耐药现象日趋严重。诸多研究数据表明,对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌耐药率最高,已经成为临床上最为难治的念珠菌。本文针对克柔念珠菌感染及耐药现状、耐药机制以及抗克柔念珠菌对策的研究进展这几大方面做一综述。

伊曲康唑联合特比萘芬成功治愈克柔念珠菌肉芽肿1例

1病历摘要患者女，66岁，农民。因左手背斑块、溃疡1年半于2009年4月20日首次来我院诊就诊。患者2007年10月份始左手背无明显诱因出现一黄豆大红色丘疹，无明显自觉症状，未予重视。丘疹逐渐增大成斑块，破溃伴少量脓液，有轻压痛。患者平素体健，否认其他系统疾病，无特殊药物应用史，否认外伤史。

天然防腐剂对克柔念珠菌的抑菌作用的研究

克柔念珠菌是萧山萝卜干中常见的真菌,其能分解葡萄糖产酸并有异味,从而破坏了产品的品质。在本试验中,选择了十余种天然防腐剂单一及两两复配溶液对该菌进行了抑菌试验。试验表明,单个防腐剂种中以茶叶和五倍子的效果为好;在复配溶液中,五倍子与丁香的效果最佳,能有效抑制该菌的生长繁殖,为萧山萝卜干生产中防腐剂超标的问题提供了解决途径和一定的理论依据。

氟尼辛葡甲胺对克柔念珠菌生物膜形成的影响及联合唑类药物效果评价

目的本研究旨在评价氟尼辛葡甲胺(FM)对克柔念珠菌生物膜形成的抑制作用以及和唑类药物联用对克柔念珠菌的体外抗菌作用。方法以患真菌性乳房炎奶牛奶样临床分离克柔念珠菌为试验菌株,采用微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MFC)初步探讨FM对克柔念珠菌的抑菌活性。水-烃两相法测定细胞表面疏水性(CSH)并通过XTT法测定FM对克柔念珠菌生物膜形成早期1~3 h黏附阶段的影响以及培养24 h后成熟生物膜的影响;以部分抑菌浓度指数(FICI)作为检测指标,通过棋盘法检测与唑类药物联用对克柔念珠菌体外静态抗菌作用;采用酶标比浊法测定绘制不同药物处理后的时间-抑菌曲线。结果FM单药对克柔念珠菌的MIC均为0.625 mg/mL;FM可以降低CSH,对不同生长阶段(早期黏附、成熟)的克柔念珠菌生物膜均有显著抑制作用,抑制作用具有时间和浓度依赖性;联合用药发现,FM与伊曲康唑联用抗克柔念珠菌的FICI介于0.5~1.5之间,表现为协同/相加作用;与酮康唑联合用药的FICI指数介于0.375~1.25之间,表现为协同/相加作用;与氟康唑联用则表现为无关;时间-抑菌曲线显示,部分唑类药物与FM联用能增强其对克柔念珠菌抑制作用,并维持较长的作用时间。结论FM是一种有效的抗真菌增效剂,可以促进伊曲康唑和酮康唑的抗真菌活性。